结构化学实验-itc等温量热滴定
ITC(等温量热滴定法)
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ITC实验注意事项
¾ Wiseman c-parameter：表征结合反应的亲和力与ITC实验设计的关系 c = n[M]K
• 样品池最大容积： VP-ITC：1.4mL ITC200 ：200μL
• 微量注射器最大容积： ITC200 ：40μL
• 单次最小注射量： ITC200 ：0.1μL
• 响应时间： ITC200 ：10s
GE Healthcare 公开技术质料
什么是等温滴定量热法？
等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，简称 ITC） ¾ 定义：
GE Healthcare 公开技术质料
ITC应用举例
评估蛋白产品质量
两个批次的同种蛋白与某一种标准多肽的结合活性比较
KD = 97 nM n=1
第1批蛋白产品 两次ITC实验： 样品池蛋白浓度 10μM 标准多肽50μM GE Healthcare 公开技术质料
KD = 135 nM n = 0.23
h0氢键范德华力疏水作用gehealthcare公开技术质料itc应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除筛选能与目标蛋白tp筛选能与目标蛋白tp特异性结合的化合物已知化合物x可与目标蛋白tp特异性结合性结合根据itc得k与其他实验方法所得结果相吻合与其他实验方法所得结果相吻合因此化合物x适于进一步研究化合物x与tp的itc结果gehealthcare公开技术质料itc应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除与tp左
等温滴定量热法（ITC）
等温滴定量热法（ITC）等温滴定量热技术摘要：⽣物⼤分⼦可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产⽣，要么吸收。
⽣物⼤分⼦与配体相互作⽤的定量描述需要确定反应过程中热⼒学参数的变化。
相互作⽤过程中产⽣的热量变化可以⽤量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是⼀种监测由结合成分的添加⽽起始的任何化学反应的热⼒学技术，它已经成为鉴定⽣物分⼦间相互作⽤的⾸选⽅法。
它通过⾼灵敏度、⾼⾃动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录⼀个变化过程的量热曲线，原位、在线和⽆损伤地同时提供热⼒学和动⼒学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了⽣物分⼦相互作⽤的真实写照。
由于⼏乎所有的⽣化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很⼴泛的应⽤，它可以应⽤于蛋⽩质-蛋⽩质相互作⽤、蛋⽩质折叠/去折叠、蛋⽩质-⼩分⼦相互作⽤、酶-抑制剂相互作⽤、酶促反应动⼒学、药物-DNA/RNA相互作⽤、RNA折叠、蛋⽩质-核酸相互作⽤、核酸-⼩分⼦相互作⽤、核酸-核酸相互作⽤、⽣物分⼦-细胞相互作⽤等⽅⾯。
关键字：等温滴定量热技术、相互作⽤、热⼒学商业化的测量⽣物分⼦相互作⽤热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被⼴泛应⽤。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作⽤的常⽤⽅法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易⽤。
分⼦识别是⼀个复杂的过程，是⽣命活动的基础。
⽣物分⼦识别过程需要结合反应的热⼒学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量⽐（n）、反应焓变（?H）、熵变（? S）、恒压热容（△Cp）和动⼒学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热⼒学参数，⽤来表征⽣物分⼦间的相互作⽤。
ITC等温量热滴定数据疑难解答
–每周使用Plates Clean script 来深度清洁系统，每次使用 pipette进样蛋白或其他粘性物质后使用Plates Syringe Clean 清洁
• 每300 个循环更换活塞头
对策: 确保进样针的密封
18 / 29-0301-14 AA
Abnormal peaks 1(3)
原因:
样品池中无样品
15.00
µ cal/sec
10.00
对策: 检测样品是否加入到了正确的孔中 5.00
0.00
-5.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
Time (min)
16
14 -16.67 0.00 16.67 33.33 50.00 66.67 83.33 100.00 116.67 133.33
Time (min)
23 / 29-0301-14 AA
信号波动1(2)
原因: 粘性蛋白或清洁不够
对策: 用去垢剂清洁样品池 提高参考功率
µ cal/sec
6
4
2
0
MicroCal™ Auto-iTC200 系统
对策: 使用 ‘plates pipette clean‘ 清洁进样针
MicroCal™ iTC200 系统
对策: 用去垢剂然后用水冲洗
原因: 进样针损坏 对策: 更换注射器
16 / 29-0301-14 AA
基线升高
原因：样品池脏 对策: 每次试验后用去垢剂清洁样品池 原因: 管道脏
itc等温滴定量热仪原理
itc等温滴定量热仪原理
ITC等温滴定量热仪原理
ITC等温滴定量热仪是一种采用滴定法进行热量测量的仪器，其工作原理主要可以分为以下几个部分：
1. 恒温环境：该仪器是由一个恒温环境构成的，该恒温环境的
环境温度可以调节，它可以精确地保持恒温，以保证测量的准确度。
2. 测量样品：在测量过程中，将样品放置在该仪器的测量室中，使其恒温，并通过恒温循环系统对样品进行持续加热，以获得热量测量结果。
3. 探头：该仪器内部设有一个探头，用于测量样品表面的温度，以及样品内部温度和溶剂滴定的温度，并可通过探头自动调节样品加热的程度，以达到精确测量的要求。
4. 滴定头：该仪器还设有一个滴定头，用于将溶液滴入样品中
进行滴定测试，以获得热量测量结果。
5. 计算机：该仪器设有一台电脑，用于记录测量结果，并对测
量结果进行分析，以计算出最终的测量结果。
以上是ITC等温滴定量热仪的工作原理，它是一种高精度的仪器，可以精确测量热量，并可以用于测定各种物质的热量测量。
ITC等温滴定量热法的操作说明解读
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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INS
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典型的ITC数据
ITC等温滴定量热法的操作说明
实验总结
实验结果的讨论及其意 义
分析实验结果，讨论相互作 用的特性、结合亲和力等， 并探讨结果对相关研究领域 的意义。
需要改进的方面
总结实验中的不足和问题， 提出改善和优化实验方法的 建议。
ITC 等温滴定量热法的 重要性
介绍ITC等温滴定量热法在生 物研究中的应用和优势，强 调其对解决科学问题的重要 性。
确保样品和配体的纯度和浓度，准备适 当的缓冲液进行滴定实验。
结果分析
信息的含义
通过分析数据，可以获得化学反 应的热效应、平衡常数、热力学 参数等信息。
数据的解释
异常情况处理
根据实验条件和数据分析结果， 解释实验中观察到的现象和趋势， 揭示背后的机理。
记录并分析实验中可能出现的异 常情况，如峰形变异、噪音等， 以确定实验结果的可靠性。
实验步骤
1
实验参数调整
2
根据实验需求，调整参数如温度、浓度、 滴定量等，以优化实验结果。
3
实验过程数据处理
4
将实验中得到的热效应数据转化为相关 参数，并进行数据分析和解释。
操作流程
按照以下步骤进行实验： 1. 样品和配体的准备 2. 初始化仪器 3. 进行等温滴定实验 4. 结束实验并保存数据
样品处理和置换缓冲液
ITC等温滴定量热法的操作说明
I. 简介 A. ITC (等温滴定量热法) 是一种测量在生物分子之间发生的相互作用的热效应的技术。 B. ITC 在生物科学研究中广泛应用，例如研究蛋白质结合、药物相互作用等。 . ITC 的优势包括无需标记物质、直接可测量热效应以及定量分析结果。 II. 实验前准备 A. 准备所需的仪器和试剂，包括等温滴定量热仪、样品和配体等。 B. 检查和准备实验所需设备，如清洗实验容器、校准测温系统等。 C. 遵守实验室的安全操作规程，戴上个人防护装备。
微量热等温滴定量热仪（ITC）
微量热等温滴定量热仪（ITC）一、仪器用途：微量热等温滴定量热仪（ITC）广泛应用于小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
二、技术指标和参数（带*者为必须具备指标）：1、应用范围包括：小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
2、应用Peltier电子温控系统保持样品室温度*3、短期噪音水平：0.2 ncal/s4、参照重复性：Mean≤1.5 μcal5、操作温度范围：2℃~80℃*6、平衡时间＜6min（从25℃至5℃）*7、温度稳定性为0.00015℃/秒（25℃时）8、最小响应时间：10 S9、测量池材质：哈司特镍碳合金(Hastelloy TM)10、测量池体积：200μl*11、实际样品需求量不超过280ul；*12、测量池类型：硬币状，固定式13、注射器：40μl，自动滴定14、最小注射体积：0.1μl*15、在线自动清洗平台，确保清洗效果的一致性及客观性，方便、快捷、易操作，减少实验操作者的劳动强度16、热补偿方式：功率反馈*17、附带控制系统，内装Origin 7数据分析软件*18、软件要求内置7种以上分析模型：单一位点，两位点，顺序位点，竞争性位点，酶动力学，解离等；*19、系统可设定三种反馈模式（高、中、低），可根据不同需要灵活选择；20、结合常数检测范围：直接检测法-从毫摩尔到纳摩尔浓度范围（102~109 M-1）间接检测法-从纳摩尔到皮摩尔范围（109~1012M-1）*21、搅拌速率：1000转以上；22、质保期1年。
23、进样针5根。
三、技术服务要求：1、供应商必须提供仪器的现场安装调试并达到投标书指标要求的技术性能，并同时在现场对用户进行操作培训。
2、仪器在调试验收合格后，提供一年免费保修服务，在保修期内，所有服务及配件全部免费，保修期外，仪器终身维修。
等温滴定量热法浓度优化
等温滴定量热法浓度优化等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学领域的实验技术。
通过测量反应在等温条件下产生或吸收的热量，ITC可以帮助研究人员了解溶液中分子之间的相互作用，如配体和受体的结合、酶催化反应以及protein-protein 相互作用。
通过优化等温滴定量热法的浓度参数，可以提高实验结果的质量和可靠性。
在优化等温滴定量热法的浓度时，有几个关键因素需要考虑。
首先是实验物质的浓度范围。
选择适当的浓度范围可以确保反应产生的热量在仪器检测范围内，同时减少背景噪音的干扰。
一般来说，对于正常的反应热量，推荐使用0.1-2.0 mM的溶液浓度。
然而，对于特殊的反应系统，需要事先进行一些初步实验，以确定最佳的溶液浓度范围。
其次是选择合适的滴定量。
滴定量是指每一次滴加到反应体系中的试剂量。
在进行等温滴定量热法实验时，滴定量的选择将直接影响到实验的敏感性和准确性。
一般来说，滴定量应尽量小，以确保每一次反应的热效应可以被仪器检测到，同时避免反应溶液的剧烈稀释或稀释不足。
通常情况下，滴定量为0.5-2.5 μL。
还需要考虑实验温度和缓冲溶液的选择。
实验温度应根据实验系统的特性和要研究的反应进行合理的选择。
对于生物体系来说，一般选择25℃或37℃作为实验温度。
而对于非生物体系，可根据需要进行调整。
缓冲溶液的选择应该使得反应体系在所选温度下保持稳定，并且不对测量结果产生干扰。
在实施等温滴定量热法浓度优化实验时，以下是一些有效的实践经验和技巧：1. 从简单到复杂地确定浓度范围。
首先可以进行一些初步实验，选择几个不同浓度的溶液进行测试，进而找到适合体系的浓度范围。
可以根据实验结果调整溶液的浓度，并逐渐扩大范围。
2. 手动混匀溶液，确保均匀分布。
在进行实验前，用手动混匀的方法将溶液均匀混合，以确保反应物质在整个试验过程中处于均一的状态。
ITC等温滴定量热法的操作说明ppt课件
律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
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Applications include:
▪Characterization of molecular interactions of small molecules
Page ▪统7 检测画作曲线。
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▪ 滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。
▪ 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变 ΔH°和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。
▪Lead optimization. ▪Enzyme kinetics. ▪Assessment of the effect of molecular structure changes
on binding mechanisms. ▪Assessment of biological activity.
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
ITC等温滴定量热法的操作说明资料
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它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、 结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔结合熵（△S）、摩尔恒 压热容（△Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差， 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸 收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
结构化学实验-itc等温量热滴定
一、实验目的：1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作3.简要分析实验结果。
二、实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。
当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。
当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
从而获得亲和力以及相关热力学数据。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。
决定曲线形状的主要参数是C值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]t/ KD × NC值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C值在10-100之间实验效果最好。
配体溶液多次次注射到ITC池的蛋白溶液中。
每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的总热量相等。
ITCintroduce等温滴定量热
ITC：测定分子相互作用的方法
在一次实验中，ITC可以测定： 结合的亲和力常数（K）； 结合反应中的焓变和熵变（ΔH、ΔS）； 结合位点数（n） 实验也可以测定有多个结合位点的样品
等温滴定量热仪(ITC)
神奇的微量热控制—功率补偿
Thanks!
ITC的优点
1. 方法开发简单； 2. 只要反应过程中有热量变化， ITC 即可作为普适的方法； 3. 是一项灵敏的技术-噪音水平 <0.01μcal/sec，利用现在的先进仪器可 以获得很高的信噪比； 4. 无需带荧光或光谱特征的底物参与反 应； 5. 单次实验即可获得数据； 6. 适用于研究多种类型的酶; 7. 可以用于不透明的样品; 8. 所得数据可以与其它方法进行比较； 9. 除了获得热力学数据外还可以获得动 力学数据。
ITC 理论基础
∆G=-RT lnKB ∆G = ∆H –T∆S
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
引发焓变和熵变的主要因素
Enthalpy (-∆H) 焓变
Hydrogen bonds 氢键
Ionic interactions 离子作用
酶反应动力学的研究(不一般的ITC曲线）
酶反应动力学应用
ITC Applications Enzyme Kinetics
Typical concentrations •Enzyme 25-100 pM •Substrate 10-100 μM (2-20 μl per injection; 15-30 injections)
Isothermal Titration Calorimetry
ITC等温滴定量热法的操作说明
ITC等温滴定量热法的操作说明ITC等温滴定量热法的操作说明1：概述ITC（Isothermal Titration Calorimetry）等温滴定量热法是一种常用于测量化学反应热效应和热力学参数的实验技术。
本文档将详细介绍ITC等温滴定量热法的操作步骤，以及常见问题的解决方案。
2：实验前准备2.1 仪器准备- 确保ITC仪器处于良好的工作状态，并进行必要的校准和检修。
- 检查仪器和相关设备的供电和冷却系统，确保正常运行。
- 准备实验所需的试剂和溶液，确保其纯度和浓度符合要求。
2.2 样品准备- 准备待测样品，确保样品的纯度和浓度符合实验要求。
- 储存样品时，注意避免暴露在空气中，以免影响实验结果。
- 如有需要，进行样品的预处理或稀释，以适应实验要求。
3：实验操作3.1 基本操作步骤- 打开ITC仪器，并进行必要的初始化设置。
- 准备试样，通常包括两种液体：溶剂和待测样品。
- 启动实验程序，并按照程序指导添加试样。
- 进行实验过程中，根据实验需要，调整实验参数，如温度、压力、浓度等。
- 当实验结束后，关闭仪器，保存实验数据。
3.2 添加试样的注意事项- 添加试样时，应尽量避免形成气泡，以免影响测量结果。
- 在添加试样前，应将样品和溶剂在相同工作温度下达到热平衡。
- 添加样品时，应使用精确的加样装置，控制加样速度和时间。
4：数据分析4.1 数据处理与解读- 对实验数据进行处理和分析，包括热流曲线的积分和差分操作等。
- 利用数据做曲线拟合，计算反应热和其他热力学参数。
- 根据数据分析结果，解释实验现象和反应机制。
4.2 出现问题的解决方案- 如实验数据异常或与理论不符，可检查实验操作是否正确，并逐步排除可能的问题。
- 如仪器出现故障或异常，应及时联系厂家进行维修或咨询专业人员的意见。
5：附件本文档附带以下附件：- ITX仪器操作手册6：法律名词及注释本文档中涉及的法律名词及其注释如下：- 1：涉及附件: 本文档所附带的相关文件或资料。
等温滴定量热法
等温滴定量热法(I T C)的简易操作流程：①样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。
a.实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴定误差；b.样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA)的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再次确认所配样品的浓度是否符合要求；c.在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。
②仪器的清洗。
a.在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变；b.样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净；c.注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA 的小试管，步骤同注射器的清洗。
③设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。
④设置滴定实验，步骤同空白试验，只需将样品池中用于空白对照的缓冲液换成蛋白样品同时修改文件名(先准备样品池中的样品，后准备注射器中的样品)。
等温滴定量热仪(ITC)
无需标记、无需检测方法开发，快速获得结果
ITC 是基于复合物形成时所放出或吸收的热量的精确测定，它是在一个实验中能够同时测量所有结 合参数的先进技术。它测量在天然状态下结合伴侣的亲和力，无需使用荧光标签修饰组分或使样品 固定化。 总而言之，ITC 是与众不同的。
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 应用研究领域目录
B
A
0 -2
ऐ ( ∆H)
10 5 փ૧ ∆G ∆H -T ∆S ᆶ૧
kcal/mole ጀ
-6 -8 -10 -12 -14 0 1 ఊܻԲ ࣅბऺଉბ (n) 2 ൕࢅ૰ (K D)
kcal/mole
-4
0 -5 -10 -Байду номын сангаас5 -20
A. ITC 测量热力学性质包括：相互作用的化学计量学（n）、亲和力常数（KD）、焓变化（∆H）、熵变化（∆S）。 B. 利用三个具有相同结合能 （∆G） 的相互作用解释热力学特征。 结合亲和力是结合焓 ( ∆H) 和结合熵 ( ∆S) 的共同作用的结果。 结合焓反映了由于氢键形成和范德华力产生的相互作用强度。结合熵是复合物形成时来自去溶剂化和构象变化的熵变化 的组合。
* 具体应用参考文献查阅可登陆
4
技术优势及应用实例 ：
将药物的先导化合物的优化 带到一个新的水平
更深刻的见解
药物应该以高亲和力和选择性结合目标。传统上，先导化合物的优化一直被剖析亲和力组成的研究 所推动。然而，热力学变量 ( ∆H, ∆S) 也是结合的基础，它们能够提供有关相互作用的更深刻的见解。 MicroCal ™量热仪具有足够的灵敏度和通量用于有效测定先导化合物优化所需的所有结合参数，以 指导先导化合物的优化。
等温滴定量热仪(iTC) 原理及操作
谢 谢！
滴定量热法早在1965年由 Christensen和Izatt提出。 该方法最初是用于弱酸-碱和 金属鳌合反应。
1978年，Beaudette和 Langerman首先将微量热法 技术用于生物体系。
等温滴定量热法原理
滴定针
参比池
样品池
等温滴定量热法原理
等温滴定量热法原理
等温滴定量热法原理
微量热法特点
生物技术导论配套实验第六讲之
等温滴定量热仪(iTC) 原理及操作
Łukasz Jaremko et al. Science 2014;343:1363-1366
▪ 等温滴定量热法 (iTC) 测量任何两个生物大分子间的结合亲和力和 热力学参数。
▪ 结合常数 (KD) ▪ 相互作用化学计量 (n) ▪ 焓 (ΔH) ▪ 熵 (ΔS)
1. 直接测量毫摩到纳摩级亲和力 (KDS)（10~2 至 10-9 M） 2. 适用范围广，轻松处理浑浊溶液 3. 非特异性强 4. 真正的溶液内技术 5. 无需标签或固定化，易于操作 6. 样品用量小,方法灵敏度高
研究方向
化学
生物化学与分子生物学
工程学
计算机科学
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ITC等温滴定量热法的操作说明资料幻灯片课件
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▪ 滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。
▪ 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH° 和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，
– 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、 注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。
– 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还 可以进行后续生化分析。
▪ 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
– 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规
《等温滴定量热法》课件
实验注意事项
实验安全注意事项
1. 定期维护和检查仪器设备 2. 穿戴实验服和防护手套 3. 室内保持通风
实验结果质量控制
1. 重复实验以确保数据准确性 2. 比对实验结果与文献数据 3. 注意实验条件的一致性
实验应用拓展
等温滴定量热法在生物化学、药物研发和化学反应研究中具有广泛的应用， 可以用于测定反应热效应、反应动力学参数等，为科学家提供有力的实验手 段。
参考文献
相关实验文献
1. Smith, J. R., et al. (2020). Isothermal titration calorimetry: A powerful tool for studying protein-ligand interactions. 2. Chen, S., et al. (2018). Application of isothermal titration calorimetry in drug discovery.
样品处理
准备待测样品，对样品进行处理和纯 化，确保实验的准确性和可靠性。
实验条件设置
设置滴定参数和实验条件，包括温度、 滴定体积等。
实验所需设备及试剂
仪器清单
1. 等温滴定量热仪器 2. 称量仪 3. 恒温搅拌器
试剂清单
1. 样品 2. 溶媒 3. 滴定试剂
实验结果分析
通过对实验中得到的数据进行处理和分析，可以得到反应热效应、平衡常数、 反应速率常数等热力学参数，并解释实验结果的意义。
实验相关资料
1. Johnson, D., et al. (2021). Isothermal titration calorimetry: Technical guidelines and good practice. 2. Gervasio, F. L., et al. (2019). Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and binding affinity quantification.
生物物理化学实验报告——ITC
结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。
实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数K D、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnK D和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N ，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数K D 。
决定曲线形状的主要参数是C 值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]tot/ KD × NC 值越大，曲线越陡；C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C 值在10-100之间实验效果最好。
实验材料：蛋白质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。
2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。
⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。
②注射器移到“Rest Position”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
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一、实验目的：
1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用
2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作
3.简要分析实验结果。
二、实验原理：
在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。
当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。
当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
从而获得亲和力以及相关热力学数据。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：
图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。
决定曲线形状的主要参数是C值：
C = 滴定池中的蛋白浓度/ K
D = [M]t/ KD × N
C值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C值在10-100之间实验效果最好。
配体溶液多次次注射到ITC池的蛋白溶液中。
每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的总热量相等。
当这种综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线。
用单位点模型来验证数据。
化学计量、结合常数及焓的数值都有显示。
三、实验步骤：
1.清洗样品池和注射池
2.注射器加样
①将装有100μl样品的PE管放入样品管槽；
②将注射器手动移动到“Rest Position”，左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，感到拧到底即可，切记不能拧死，否则注射器会损坏；
③在“Instrument Control”界面中点击“Syringe Fill”，检查正常后点击OK；
④将注射器移动到“Loading Position”针头插入到试管中，点击OK，开始吸取样品，待加满后取下白色细管，放回原位；
3.样品池加样
①用玻璃注射器吸取300μl的样品，轻弹注射器壁赶出气泡；
②将注射器对准样品池中间小孔慢慢插入，轻触底部后抬起1mm；
③用手稳住针筒，缓慢推入样品至样品溢出样品孔，重复吸取赶出样品池中的气泡；
④同样的，在参照池中加入水和Buffer；
4.设置相关的试验参数：总加样次数，样品池温度，搅拌速度，单词滴定体积和间隔时间
四、实验结果及数据处理
由图中曲线可以看出，滴定曲线较好，蛋白之间的亲和常数为K D=5.80×105（±3.92×104）; 焓变△H=-3134±12.66cal/mol=-13106.39±52.94J/mol;
反应熵变△S=15.9cal/mol/deg=66.49J/mol/deg;
结合比N=1.09，即为1:1.09；
反应的自由能为ΔG =- RT lnK D =-8.314×298×ln5.80×105≈-32.87KJ/mol;
ΔG = ΔH–TΔS=(-13106.39-298×66.49)=-32.92KJ/mol。