荧光免疫技术抗核抗体
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（9）封片时候将盖玻片放于加样板上，于相应的数字位置轻轻 点滴甘油，甘油的量不易过多，挤出后在其成滴落下前在玻 片上点滴。
（10）荧光染色后应尽可能及时观察， 不能及时观察应4℃避光 保存，以减少荧光淬灭。
IIF法检测ANA荧光染色模型
细胞核 细胞浆
均质型 颗粒型 核仁型 着丝点型 周边型 核点型
(勿用力挤压)
封片不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。 可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
注意事项
（1）试剂不经复温直接使用会降低反应温度，底物片凝 集水珠会影响反应效果，使用前要复温。
（2）标本稀释应准确，样本浓度过高或过低会造成假阳 性或假阴性结果。
（3）FITC标记的荧光二抗使用前需混匀。 （4）反应时间应严格控制，延长或缩短反应时间将影响
特点：分裂期、分裂间期细 胞胞质内、细胞核旁 可见圆形或棒状荧光， 细胞核阴性
相关疾病：丙肝，尤其是干 扰素或者利巴韦林治 疗后
ANA
根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：
核均质型： DNA、组蛋白和核小体等 核糖核蛋白：Sm、RNP、SS-A、SS-B
细胞核
斑点型 周边型：
Ku 细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型 板层素、gp210等
传统定义：是指抗细胞核抗原成分的自身抗体 狭义定义
现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体 对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指 一类抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体的总称 广义定义
ANA细胞靶抗原成份模式图
Leabharlann Baidu分泌颗粒
中心粒
高尔基体 粗面内质网
滑面内质网
真核细胞
核仁
线粒体
核粒子
糖原颗粒
溶酶体
反应效果。 （5）洗涤步骤是影响检测结果最关键的一步，洗涤不充
分将会增加非特异染色，从而影响观察效果。
注意事项
（6）洗涤时先冲洗后浸泡，注意水流不要太急，不要直接对着 基质冲。
（7）擦板要小心，要分清正反面, 擦拭抗原板四周的液体要求小 心，不能碰到抗原板上包被地组织切片。
（8）盖片的时候，要将薄片上的凹孔对准加样板左边的小突起， 然后轻轻放下，见液滴完全浸泡住组织切片。
试剂与器材
➢ ANA检测试剂盒 包被组织切片的生物薄片（Hep2细胞、猴肝片） PH7.2 磷酸盐缓冲液/吐温20 标记FITC羊抗人二抗 阴性、阳性质控 石蜡（封片介质，PH8.4） ➢ 加样枪，试管，洗片槽，荧光显微镜
ANA检测原理和步骤
⑥ 荧光显微镜观察
⑤ 洗去多余荧光二抗
④ 加入荧光二抗反应
核点型
特点：细胞核部位分布大小较为 均匀的10个左右点状颗粒
相关疾病：自免肝病、系统性硬化
着丝点型
特点：分裂期大小数目大致相同的点状荧 光
相关疾病：局限性硬皮病
胞浆细颗粒型
特点：胞浆颗粒细且均匀，核仁 有染，疑为核糖体抗体
相关疾病：SLE
胞浆粗颗粒型
特点：胞浆颗粒粗且不均匀，核仁无染， 疑为线粒体抗体(M1~M10)
包被组织切片的生物薄片 加样板
加25ul待测样本后盖板, 避免产生气泡
室温温育30分钟
浸洗至少5分钟
擦干生物薄片四周洗液
洗涤（先冲洗后浸泡）
PBSTween20
操作步骤
加样板上加入FITC标记 20ul二抗后，盖板
PBSTween20
荧光显微镜下观察结果
室温温育30分钟 洗涤（先冲洗后浸泡）
浸洗至少5分钟 擦干薄片四周洗液 石蜡(一小滴)封片
斑点型
特点：分裂间期：核质呈颗粒荧光（藕孔状） 分裂期：染色体部位无荧光（0型）
相关疾病：SLE、MCTD、SS等
核仁型
特点：分裂间期：核质均匀染色 分裂期：染色体无荧光（0型）
相关疾病：硬皮病、皮肌炎等
周边型（核膜型）
特点：分裂间期：核周边荧光环增强 分裂期：染色体无荧光（0型）
相关疾病：自身免疫性肝病
F
③ 洗去未反应血清蛋白
② 加入标本反应
自身抗体
非特异
F
蛋F白
① HEp-2细胞（底物片试剂盒） 检测过程 : 2 步反应 + 2步洗涤 + 1步观察
操作步骤
阴阳质控 不稀释 待测血清稀释100倍 20ul血清+2mlPBS 稀释液
生物薄片编号，如1,2,3
实验报告注明所加样本号 (如1-1,5051；1-2,5047)
荧光免疫技术
抗核抗体（ANA）检测 间接免疫荧光法（IIF）
黄卓春
免疫学 检测方法
免疫沉淀法 免疫凝集法 酶免疫检测技术 荧光免疫技术 电化学发光技术 ……
共同的基础
抗原抗体 反应
检测方法 沉淀 凝集 显色 荧光 电子发光 ……
荧光免疫技术——抗原抗体反应与荧光标记技术 结合，对抗原 或抗体进行定性、定位或定量检测
细胞膜 细胞骨架蛋白
抗核抗体的检测
推荐采用以HEp-2细胞（Human Epithelial Cells,人 喉癌上皮细胞株）为底物的间接免疫荧光法 (Indirect ImmunoFluorescence assays, IIF)
优点：① HEp-2细胞形态大，细胞抗原种类齐全， 分裂期成份（如着丝点、纺缍体、中心粒） 等丰富（抗原齐全） ②IIF法可直接观察针对细胞成份的抗体（形 态直观）
相关疾病：原发性胆汁性肝硬化
高尔基体型
特点：细胞核旁不规则帽状染色 相关疾病：SLE、SS
溶酶体型
特点：胞浆内油珠状染色 相关疾病：不明，中国人极罕见
中心粒型
特点：分裂期细胞中荧光点位于 细胞纵向对称的两极
相关疾病：不清
纺缍体型
特点：细胞分裂期对称纺缍型染色 相关疾病：不清
抗rings and rods(RR)抗体
核仁型： Scl-70、RNA多聚酶和原纤维蛋白等 核点型： 着丝点、核点等
抗核抗体的检测——间接免疫荧光法
荧光免疫技术 间接 荧光标记的二抗
直接法：
F
荧光标记的抗体
优点：步骤少
缺点：每种抗体都需
要标记荧光，不通用
F 间接法： 荧光标记的二抗 优点：通用荧光二抗 缺点：步骤多
抗核抗体的定义 抗核抗体的检测 抗核抗体的临床意义 抗核抗体检测策略 讨论要求
抗核抗体的定义
ANA（antinulear antibody）定义
核糖体型 线粒体型 高尔基体型 溶酶体型 胞浆颗粒型
细胞骨架
肌动蛋白型 波形蛋白型 细胞角蛋白型 原肌球蛋白型 纽带蛋白型
细胞周期
中心粒型 纺缍体型
PCNA型
分离带型
占80%以上
注：核颗粒型又称核斑点型
ANA荧光染色模型实例
均质型
特点：分裂间期：核质均匀染色 分裂期：浓缩染色
相关疾病：SLE、药物狼疮等
（10）荧光染色后应尽可能及时观察， 不能及时观察应4℃避光 保存，以减少荧光淬灭。
IIF法检测ANA荧光染色模型
细胞核 细胞浆
均质型 颗粒型 核仁型 着丝点型 周边型 核点型
(勿用力挤压)
封片不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。 可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。
注意事项
（1）试剂不经复温直接使用会降低反应温度，底物片凝 集水珠会影响反应效果，使用前要复温。
（2）标本稀释应准确，样本浓度过高或过低会造成假阳 性或假阴性结果。
（3）FITC标记的荧光二抗使用前需混匀。 （4）反应时间应严格控制，延长或缩短反应时间将影响
特点：分裂期、分裂间期细 胞胞质内、细胞核旁 可见圆形或棒状荧光， 细胞核阴性
相关疾病：丙肝，尤其是干 扰素或者利巴韦林治 疗后
ANA
根据产生的荧光模型、靶抗原的分布部位分类如下：
核均质型： DNA、组蛋白和核小体等 核糖核蛋白：Sm、RNP、SS-A、SS-B
细胞核
斑点型 周边型：
Ku 细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型 板层素、gp210等
传统定义：是指抗细胞核抗原成分的自身抗体 狭义定义
现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体 对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指 一类抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体的总称 广义定义
ANA细胞靶抗原成份模式图
Leabharlann Baidu分泌颗粒
中心粒
高尔基体 粗面内质网
滑面内质网
真核细胞
核仁
线粒体
核粒子
糖原颗粒
溶酶体
反应效果。 （5）洗涤步骤是影响检测结果最关键的一步，洗涤不充
分将会增加非特异染色，从而影响观察效果。
注意事项
（6）洗涤时先冲洗后浸泡，注意水流不要太急，不要直接对着 基质冲。
（7）擦板要小心，要分清正反面, 擦拭抗原板四周的液体要求小 心，不能碰到抗原板上包被地组织切片。
（8）盖片的时候，要将薄片上的凹孔对准加样板左边的小突起， 然后轻轻放下，见液滴完全浸泡住组织切片。
试剂与器材
➢ ANA检测试剂盒 包被组织切片的生物薄片（Hep2细胞、猴肝片） PH7.2 磷酸盐缓冲液/吐温20 标记FITC羊抗人二抗 阴性、阳性质控 石蜡（封片介质，PH8.4） ➢ 加样枪，试管，洗片槽，荧光显微镜
ANA检测原理和步骤
⑥ 荧光显微镜观察
⑤ 洗去多余荧光二抗
④ 加入荧光二抗反应
核点型
特点：细胞核部位分布大小较为 均匀的10个左右点状颗粒
相关疾病：自免肝病、系统性硬化
着丝点型
特点：分裂期大小数目大致相同的点状荧 光
相关疾病：局限性硬皮病
胞浆细颗粒型
特点：胞浆颗粒细且均匀，核仁 有染，疑为核糖体抗体
相关疾病：SLE
胞浆粗颗粒型
特点：胞浆颗粒粗且不均匀，核仁无染， 疑为线粒体抗体(M1~M10)
包被组织切片的生物薄片 加样板
加25ul待测样本后盖板, 避免产生气泡
室温温育30分钟
浸洗至少5分钟
擦干生物薄片四周洗液
洗涤（先冲洗后浸泡）
PBSTween20
操作步骤
加样板上加入FITC标记 20ul二抗后，盖板
PBSTween20
荧光显微镜下观察结果
室温温育30分钟 洗涤（先冲洗后浸泡）
浸洗至少5分钟 擦干薄片四周洗液 石蜡(一小滴)封片
斑点型
特点：分裂间期：核质呈颗粒荧光（藕孔状） 分裂期：染色体部位无荧光（0型）
相关疾病：SLE、MCTD、SS等
核仁型
特点：分裂间期：核质均匀染色 分裂期：染色体无荧光（0型）
相关疾病：硬皮病、皮肌炎等
周边型（核膜型）
特点：分裂间期：核周边荧光环增强 分裂期：染色体无荧光（0型）
相关疾病：自身免疫性肝病
F
③ 洗去未反应血清蛋白
② 加入标本反应
自身抗体
非特异
F
蛋F白
① HEp-2细胞（底物片试剂盒） 检测过程 : 2 步反应 + 2步洗涤 + 1步观察
操作步骤
阴阳质控 不稀释 待测血清稀释100倍 20ul血清+2mlPBS 稀释液
生物薄片编号，如1,2,3
实验报告注明所加样本号 (如1-1,5051；1-2,5047)
荧光免疫技术
抗核抗体（ANA）检测 间接免疫荧光法（IIF）
黄卓春
免疫学 检测方法
免疫沉淀法 免疫凝集法 酶免疫检测技术 荧光免疫技术 电化学发光技术 ……
共同的基础
抗原抗体 反应
检测方法 沉淀 凝集 显色 荧光 电子发光 ……
荧光免疫技术——抗原抗体反应与荧光标记技术 结合，对抗原 或抗体进行定性、定位或定量检测
细胞膜 细胞骨架蛋白
抗核抗体的检测
推荐采用以HEp-2细胞（Human Epithelial Cells,人 喉癌上皮细胞株）为底物的间接免疫荧光法 (Indirect ImmunoFluorescence assays, IIF)
优点：① HEp-2细胞形态大，细胞抗原种类齐全， 分裂期成份（如着丝点、纺缍体、中心粒） 等丰富（抗原齐全） ②IIF法可直接观察针对细胞成份的抗体（形 态直观）
相关疾病：原发性胆汁性肝硬化
高尔基体型
特点：细胞核旁不规则帽状染色 相关疾病：SLE、SS
溶酶体型
特点：胞浆内油珠状染色 相关疾病：不明，中国人极罕见
中心粒型
特点：分裂期细胞中荧光点位于 细胞纵向对称的两极
相关疾病：不清
纺缍体型
特点：细胞分裂期对称纺缍型染色 相关疾病：不清
抗rings and rods(RR)抗体
核仁型： Scl-70、RNA多聚酶和原纤维蛋白等 核点型： 着丝点、核点等
抗核抗体的检测——间接免疫荧光法
荧光免疫技术 间接 荧光标记的二抗
直接法：
F
荧光标记的抗体
优点：步骤少
缺点：每种抗体都需
要标记荧光，不通用
F 间接法： 荧光标记的二抗 优点：通用荧光二抗 缺点：步骤多
抗核抗体的定义 抗核抗体的检测 抗核抗体的临床意义 抗核抗体检测策略 讨论要求
抗核抗体的定义
ANA（antinulear antibody）定义
核糖体型 线粒体型 高尔基体型 溶酶体型 胞浆颗粒型
细胞骨架
肌动蛋白型 波形蛋白型 细胞角蛋白型 原肌球蛋白型 纽带蛋白型
细胞周期
中心粒型 纺缍体型
PCNA型
分离带型
占80%以上
注：核颗粒型又称核斑点型
ANA荧光染色模型实例
均质型
特点：分裂间期：核质均匀染色 分裂期：浓缩染色
相关疾病：SLE、药物狼疮等