(整理)伪狂犬检测报告

伪狂犬检测报告一例猪伪狂犬病毒病的诊治报告

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一例猪伪狂犬病毒病的诊治报告

作者：覃国喜

来源：《中国动物保健》2014年第09期

猪伪狂犬病的致病源为I型疱疹病毒，是一种急性传染病。多会引起母猪的繁殖障碍，仔猪的急性死亡，侵害多种组织器官的恶心疾病。怀孕母猪感染该猪伪狂犬病毒后，可导致母猪流产，临床上常见的流产的胎儿有死胎、木乃伊胎及弱仔等；对已顺利降生、母原抗体不高的仔猪可造成大批急性死亡，临床常见的症状有呕吐、震颤、腹泻及运动失调等临床症状；耐受猪易产生免疫抑制，增加了猪只感染其它疾病的风险，影响仔猪生长发育。

研究表明，发病的猪、潜伏感染排毒的猪为本病重要传染源。除此之外，实验动物中兔、小鼠、大鼠、豚鼠等也是猪伪狂犬病毒的贮存宿主，引起该病的发生与流行。笔者将成功治疗的一例猪伪狂犬病诊疗过程记叙如下，旨在为广大兽医工作者提供借鉴。

1 发病情况介绍

广西某猪场，存栏猪1 000余头。4月5日，猪场内出现新生仔猪大量死亡，新生仔猪出生第一天表现正常，第二天开始发病，体温41℃以上，精神极度萎顿，身体发抖，运动不协调，死亡高峰期出现在发病后的3～5 d内。明显的神经症状是该病的主要临床症状，一旦发病，1～2 d内死亡。新生仔猪的发病死亡率可达100%。断奶仔猪也有发病，主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等，死亡率在10%。怀孕母猪发生流产、产木乃伊胎儿。

2 病例变化及实验室检测

对病死猪及濒死猪进行了解剖，眼观病变主要有肾脏有针尖状出血点，脑膜明显充血，有些在肝、脾等脏器常可见灰白色坏死病灶。脑、脾、肝等器官取样进行实验室的细菌学和猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）的检测。

无菌采取病料后直接涂片、革兰氏染色、镜检后未发现有细菌；同时对病料在血琼脂平板培养，37℃培养24 h未见有细菌增殖，排除了该病由细菌引起。对所采取的病料进行

RCR/RT-PCR检测，在病猪的脑组织中检测到PRV的核酸物质（见图1），而在其他组织均为检测到PPV、JEV、PRRSV、CSFV等病毒的核酸物质。

3 诊断结果

根据疾病的临诊症状，流行病学及实验室检测结果，确定该猪场

发生了由PRV病毒引起的猪伪狂犬病毒。

4 治疗及预防措施

篇二：猪伪狂犬病野毒抗体不同检测单位的比对试验

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猪伪狂犬病野毒抗体不同检测单位的比对试验

作者：孙华宋忠旭曾德芳等

来源：《湖北农业科学》2013年第24期

摘要：在种猪群伪狂犬病野毒（gE）抗体监测的第一阶段，进行了不同检测单位的比对试验。对来自71个个体间隔1周的两次血清样本进行检测，2个检测机构之间的gE抗体阳性符合率分别为35.71%、45.45%，总体检测符合率分别为87.32%、91.55%；2个检测机构各自的gE抗体阳性符合率分别为40.00%、75.00%，总体检测符合率分别为87.32%、97.18%。表明在猪群进行伪狂犬病野毒感染鉴定的初期，有必要对检测单位进行筛选。

关键词：伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）；野毒抗体；对比试验

中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6124-02

伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种动物共患传染病，以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状[1]。猪感染伪狂犬病毒后主要表现为母猪流产、死胎等繁殖障碍[2]，哺乳仔猪尖叫、腹泻和转圈、大量发病死亡，保育猪神

经症状，育肥猪呼吸道症状、生长发育缓慢。猪伪狂犬病对养猪生产的影响很大，给中国的养猪业特别是集约化养猪造成了巨大经济损失[3]。

国家生猪产业技术体系疫病控制研究室“十二五”重点任务“伪狂犬病、猪瘟净化与蓝耳病综合防控”中要求，在伪狂犬病净化任务结束时，参与试验的种猪场（或生产线）应全部为野毒gpI （gE）抗体阴性。根除和净化措施分为普查、强化免疫控制、检测淘汰、全群清群与引种、监测认证与维持等5个阶段，在实施过程中，检测结果将影响净化的具体方案和实施细节。本研究在种猪群伪狂犬病野毒感染状况监测的第一阶段，进行了猪伪狂犬病野毒抗体不同检测单位检测结果的比(转载于: 写论文网:伪狂犬检测报告)对试验，现将试验情况及建议报告如下，以供养猪生产中猪群伪狂犬病等疾病检测、净化时参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂

试验猪为湖北省农业科学院实验原种猪育种场基础母猪520头，种公猪19头，自繁自养。gE基因缺失弱毒疫苗（K-61株自然缺失基因苗），德国柏林格茵格翰公司。后备猪在70日龄和配种前各免疫1次，种母猪每年普免3次，普免时避免在分娩前7 d内接种，以减少接种应激对分娩的影响，并在母猪分娩后补免；公猪采用集中普免的方式，每年免疫3次。

篇三：伪狂犬病检测方法

十一、伪狂犬病检测方法

伪狂犬病病毒分离鉴定

1 材料准备

DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录)

2 操作步骤

2.1 病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。

2.2 样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。

2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。

2.4 观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三

代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。

2.5 病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应

1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录)

引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，

下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3

仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪

2操作步骤：

2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。

2.2 样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN 缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清

液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。

2.3. PCR的操作程序先将制备的模板DNA置100℃水浴10分钟作变性处理，，然后立即放于冰浴中。PCR反应体系为：总体积25μl，含有50m ?mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1％Triton X-100?，?100?μmol/L dNTPs，0.35μmol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1μl模板DNA。

常用的反应体系组成如下

10×缓冲液2.5 μl

15mM MgCl22.5 μl

dNTPs 2.0 μl

引物各2.0μl

Taq聚合酶1.0μl

DNA模板2.0μl

灭菌去离子水11.0μl

矿物油约20μl

扩増条件为:94℃变性3分钟，进入循环，94℃60秒，65℃60秒，72℃60秒，40个循环后72℃延伸5分钟。

2.4PCR产物的检测PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2％琼脂

糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较，可见产生的140bp和77bp两个片段。

伪狂犬病荧光抗体试验

1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录D(标准的附录)

2操作步骤

2．1样品采集扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。

2．2 切片制备将样品组织块切成1cm ×1cm的面，不经任何固定处理，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求5—7um，将切片展贴于0.8mm×1mm厚的洁净载

玻片上。

2．3固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸

盐缓冲液中，轻轻漂洗3—4次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色。

2．4 染色将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37℃作用30分钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.0—9.5碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。

2．5 观察将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。

2．6判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中出现明亮的黄绿色荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。

伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）

1 材料准备

0. 25%胰酶（配制见附录B）、BHK-21细胞,多道可调微量移液器, ,96孔细胞培养板,CO2培养箱, 倒置显微镜。

2 操作步骤

2.1 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）的测定：

2.1.1 病毒培养和收获将伪狂犬病毒接种于长成单层的BHK-21细胞，接种量为液体培养基量的10%,37℃培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。

2.1.2 病毒的滴定用DMEM培养基将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10—1、10—2??每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞100μL（细胞含量以105/mL左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37℃5%CO2培养箱中。

2.1.3 TCID50计算逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50（具体的计算示例见附录B）。

2.2 中和试验将无菌采集的待检猪血清置56℃水浴灭活30分

钟。用DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入50μL培养基，随后在第一孔中加入经待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL再加入第三孔中，依此类推。血清稀释度即为1：2、1：4、1：8??，每份待检血清稀释度作2—4个重复。将50μL含200个TCID50的病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37℃作用1小时，每孔中再加入100μL经胰酶消化分散的BHK-21细胞，同时设病毒对照、阳性血清、阴性血清，待检血清、正常细胞对照。

2.3计算抗体中和效价逐日观察，直至细胞对照出现老化脱落为止，按Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为1：2及1：2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。

伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）

1材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPD—H2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(标准的附录)

2 操作步骤：

2.1 包被将PRV抗原加入酶标板孔内，每孔100uL，37℃作用1h后置4℃冰箱过夜。

2.2 洗涤弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干

2.3 封闭各孔加入封闭液100uL 37℃作用1h。按2.2步骤洗涤2．4 加入待检血清待检血清经56oC30分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每孔100uL，37℃作用1h。重复2.2步骤。

2．5 加入酶标抗体用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37℃作用1h。重复2.2步骤。

2．6 加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。

2．7 终止反应每孔加入50uL终止液终止反应。

2．8 测定OD值在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。2．9血清阴阳性判定标准的确定取60份经中和试验检测为PRV 抗体阴性的猪血清，按1:20稀释后进行间接ELISA试验，测定490nm波长处OD值，规定以60份血清的平均OD值加上3倍标准差作为判定阴阳性的临界值。

伪狂犬病乳胶凝集试验

1材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，溶液配制见附录E(标准的附录)

2操作步骤：

2．1待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理

2．2将待检血清用稀释液作倍比稀释后，各取15μL与等量乳胶凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在3—5分钟内观察结果；可能出现以下几种凝集结果，即：

100%凝集：混合液透亮，出现大的凝集块

75%凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集块

50%凝集：约50%乳胶凝集，凝集颗粒较细

25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒

0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒出现

如出现50%凝集程度以上的（含50%凝集程度），判为伪狂犬病抗体阳性，

否则判为抗体阴性。如为阴性，可用微量中和试验进一步检测。伪狂犬病琼脂扩散试验

1材料准备琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清；优质琼脂粉、平皿2操作步骤

2．1 0.8%琼脂板的制作将1克琼脂粉溶于100毫升Tris─盐酸缓冲液(Tris 6.5克, NaCl

2.9克, NaN3 0.2克, 蒸馏水1000毫升, 用HCl调pH值至7.2)中，趁热倾倒于玻璃平皿上，厚度为2—3mm，待冷却凝集后，打孔，中央一孔，周围6孔，孔径为2mm，周围孔之间距离2mm，周围孔与中央孔间距为4mm—6mm，用酒精灯微热封底。

2．2加样将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周围孔加经热灭活的待检血清，设阴性血清和阳性血清对照。置温盒37℃作用，24—48小时后观察结果。

2．3结果判定在抗原孔与待检血清孔之间出现白色沉淀线，抗体可判为阳性；如待检血清抗体水平较低，可以观察到与待检血清相邻的阳性血清沉淀线末端略向抗原抗弯曲。阴性血清与抗原孔之间则没有沉淀线。

伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验

1．猪伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验

伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。

1．1材料准备：伪狂犬病毒gG蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、

伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。1．2操作步骤

1．2．1对照试验检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立，否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加gG蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gG 基因缺失疫苗血清加gG蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gG基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。

1．2．2检测试验

1．2．2．1待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1．2．2．2待检血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果(注：gG蛋白致敏乳胶抗原与血清反应的凝集颗粒较细)；可能出现以下几种凝集结果，即：“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；

“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；

“++”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；

“+”有少许凝集，液体呈混浊；

“—”液滴呈原有的均匀乳状。

以出现“++”以上凝集者判为阳性凝集。

2．猪伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集试验

伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gE基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗gE蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染猪与gE基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。

1．1材料准备：伪狂犬病毒gE蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。

1．2操作步骤

1．2．1对照试验检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立，否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加gE蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gE 基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳胶抗原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gE基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。

1．2．2检测试验

1．2．2．1待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1．2．2．2待检血清一滴，置于玻片上。加gE蛋白致敏乳胶抗

原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果(注：gE蛋白致敏乳胶抗原与血清反应的凝集颗粒较细)；可能出现以下几种凝集结果，即：“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；

“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；

“++”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；

“+”有少许凝集，液体呈混浊；

“—”液滴呈原有的均匀乳状。

以出现“++”以上凝集者判为阳性凝集。