脂溶性维生素检测方法研究-贺平丽
保健食品中9种脂溶性维生素的测定BJS201717
附件5保健食品中9种脂溶性维生素的测定BJS 2017171范围本方法规定了营养素补充剂类保健食品中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K1、维生素K2、β-胡萝卜素含量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本方法适用于营养素补充剂类保健食品中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K1、维生素K2、β-胡萝卜素含量的测定。
2原理试样经混合溶液（异丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80，v:v:v）提取后，采用液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。
3试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1甲醇：质谱级。
3.1.2乙腈：质谱级。
3.1.3异丙醇：色谱纯。
3.1.4丙酮。
3.1.5二氯甲烷。
3.1.6提取溶液（异丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80，v:v:v）：取异丙醇50mL、二氯甲烷50mL，用甲醇稀释至500 mL，混匀。
3.1.7 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1 mL用水稀释至1 000 mL，用滤膜（3.4）过滤后备用。
3.1.8 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸1 mL用甲醇稀释至1000mL，用滤膜（3.4）过滤后备用。
3.2标准品维生素A、维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K1、维生素K2、β-胡萝卜素标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度≥98%。
3.3标准溶液配制3.3.1标准储备液（100μg/mL）—41 —3.3.1.1维生素K1标准储备液：称取0.01 g（精确至0.000 1 g）的维生素K1标准品（3.2），加入5mL丙酮（3.1.4）溶解，用甲醇转移并定容于100 mL棕色容量瓶中。
3.3.1.2 β-胡萝卜素标准储备液：称取β-胡萝卜素标准品（3.2）0.01 g（精确至0.000 1 g），用二氯甲烷（3.1.5）溶解，转移并定容至100 mL棕色容量瓶中。
血液中水、脂溶性的检测
血液中脂溶性维生素的检测1、仪器与试剂HP1220高效液相色谱仪、氮吹仪、漩涡振荡器、离心机维生素A、维生素D、维生素E标品；无水乙醇；正己烷；甲醇（色谱级别）2、标准溶液配制1mg/ml维生素标准储备液：3种维生素标品各0.01g于10ml 容量瓶中，甲醇定容。
工作液浓度（ug/ml) 量取的母液体积（ml）定容体积（ml）维生素A 40 2 50维生素D 10 1 100 维生素E 400 4 103、实验方法3.1 色谱条件设置色谱柱C18柱进样体积(ml）20ul泵流动相甲醇97%纯化水3%流速1ml/min 柱温25℃检测波长0-8min 315nm8-12min 265nm12-16min 290nm3.2 测定方法取血清0.2ml置5ml具塞离心管中，加入0.2ml无水乙醇沉淀蛋白质，后加入正己烷 1.0ml，旋涡振荡器振荡2min，8000r/min离心5min，吸取上层正己烷液0.5ml，氮气吹干，0.2ml流动相溶解残渣，旋涡振荡器振荡30s，15000r/min离心2min，取上清液到进样瓶。
4、上机进样测量物质波长设置V A标品315nmVD标品265nmVE标品290nm血清样品可变波长其他色谱条件与上述一致血液中水溶性维生素的检测1、仪器与试剂HP1220高效液相色谱仪、氮吹仪、涡旋振荡器、离心机、ODS C18固相萃取柱（100mg/1ml）维生素标准品：VB1、VB3、VC、叶酸；0.01mol/l HCL溶液；1mol/l KOH溶液; 甲醇；50mmol/l NH4H2PO4溶液（PH6.0）；VC提取溶剂：乙二酸四乙酸二钠0.005g，二硫苏糖醇0.05g，加适量水溶解，加入高氯酸1.42ml，加水定容至50ml。
2、标准溶液配制VB1、VB3、标准储备液（1mg/ml），用0.01mol/l HCL配制；叶酸标准储备液（1mg/ml）,以1滴1mol/lKOH溶解后，在用0.01mol/l HCL定容。
标准应用方法-脂溶性维生素的检测方法（20130321）
标准应用方法-脂溶性维生素的检测方法（20130321）饲料添加剂中四种脂溶性维生素的检测1.摘要应用HALO柱，建立一种用反相高效液相色谱测定饲料添加剂中4种脂溶性维生素的分析方法。
方法采用HALO C18色谱柱（4.6×50mm，2.7 μm），以乙腈－水为流动相进行梯度洗脱，流速2 mL/min，检测波长采用波长时间程序，分别在251nm和280nm 下检测，4种水溶性维生素7 min内完成分离检测。
维生素A乙酸酯、维生素K3线性范围0.8-80.0μ/mL，维生素D3、维生素E线性范围2.0-200.0μ/mL，测得维生素的检测限介于4×10-9g/mL~4×10-8g/mL之间(S/N>2)。
样品回收率为89%-100%这一方法操作简便快速、准确可靠，适用于饲料中脂溶性维生素的测定。
2.关键词反相高效液相色谱；脂溶性维生素；HALO柱。
3.范围本方法适用于饲料中脂溶性维生素的检测。
本方法适用于高效液相色谱法分析脂溶性维生素。
本方法可测定4种维生素，包括：维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E、维生素K3。
本方法测定各维生素最低检测限不高于4×10-8g /mL。
4.规范性引用文件GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。
5.定义5.1维生素维生素又名维他命，通俗来讲，即维持生命的物质，是维持生物体生命活动必须的一类有机物质，也是保持生物体健康的重要活性物质。
维生素在体内的含量很少，但不可或缺。
各种维生素的化学结构以及性质不同。
维生素是个庞大的家族，目前所知的维生素就有几十种，大致可分为脂溶性和水溶性两大类。
6.原理样品经提取后，用反相高效液相色谱进行色谱分析，采用外标法定量。
7.试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
7.1 乙腈：色谱纯7.2 超纯水：蒸馏水以0.22 um水系滤膜过滤即得。
7.3 标准品：维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E、维生素K3，纯度均大于等于97%。
脂溶性维生素的测定
3.2 标准曲线制备 准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶 中，以三氯甲烷配制标准系列。
取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系 列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色系 列。
于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点， 将其标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9mL 三氯化锑－三氯甲烷溶液。于6s内测定吸光度。 以吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘 制标准曲线图。
提取： 洗涤： 浓缩：
水洗
皂化瓶内混合物 分液漏斗1号 振摇，静置，分层
乙醚洗
提 取
醚层
水层 分液漏斗2号
振摇，静置，分层
醚层 分液漏斗1号 醚层 水层 分液漏斗3号 振摇，静置，分层 水层
水洗
分液漏斗1号
振摇，静置，分层
水层
醚层
振摇，静置，分层
KOH溶液洗
净 化
KOH溶液层
醚层
振摇，静置，分层
3.3 样品测定 于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸 酐为空白液。 另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中 分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐。 其余步骤同标准曲线的制备。 4 结果计算
C 100 X V m 1000
（二）高效液相色谱法
1.原理
样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处
维生素A的测定பைடு நூலகம்
维生素A类是指含有β-白芷酮环的多烯基结构、并具有视 黄醇生物活性的一大类物质。广义而言包括已经形成的维 生素A和维生素A原。 动物体内具有视黄醇生物活性功能的维生素A类包括视黄 醇、视黄醛、视黄酸等物质，4-氧视黄酸、4-羟视黄酸等 不具有视黄醇生物活性功能。 维生素A分为维生素A1和维生素A2，A1主要存在于海产 鱼中，A2主要存在于淡水鱼中。 在植物中不含已形成的维生素A，在黄、绿、红色植物中 含有类胡萝卜素，其中一部分可在体内转变成维生紊A的 类胡萝卜素称为维生素A原，如α-胡萝卜素、β-l胡萝卜素、 γ-胡萝卜素等。目前已经发现的类胡萝卜素约600种，仅有 约1/10为维生素A原。
HPLC法同步测定饲料中脂溶性维生素的开题报告
HPLC法同步测定饲料中脂溶性维生素的开题报告
一、研究背景和意义
脂溶性维生素是动物体内正常代谢所必需的营养物质。
而且，它们的吸收、转运和代谢过程受到饲料中其他成分的影响。
包括饲料油脂、饲料中蛋白质的水平和品质、饲料中非饱和脂肪酸的水平和种类等。
因此，对饲料中脂溶性维生素的测定非常重要。
现有方法为HPLC法，该方法准确、灵敏度高、选定条件简单、流程短。
本文选用HPLC法同步测定饲料中脂溶性维生素。
二、研究内容及方法
2.1 研究内容
本研究选用HPLC法同步测定饲料中四种脂溶性维生素：维生素 A、维生素 D、维生素E、维生素 K。
2.2 研究方法
（1）样品制备：取少量饲料样品，经过煮沸或其他预处理方法，使样品中维生素的分子结构被破坏，便于提取和分离。
（2）提取和分离：用有机溶剂（如乙醚、正己烷等）提取饲料中的维生素，并通过硅胶柱层析等方法分离维生素，获得纯品。
（3）HPLC分析：采用反相高效液相色谱法对四种脂溶性维生素进行定量测定。
选定适当色谱柱和移动相，利用外标法构建定量曲线，通过色谱图的峰形、保留时间及特征峰检出，确认样品中各种脂溶性维生素的存在和浓度。
三、预期成果与意义
通过研究HPLC法同步测定饲料中脂溶性维生素的方法，可以帮助养殖生产所需的饲料质量检测，并为动物营养学研究提供可靠的数据支持。
该方法简单可靠，成本低，对于提高饲料生产质量和动物营养指标的提高具有积极的推动作用。
食品中脂溶性维生素分析的新方法
食品中脂溶性维生素分析的新方法脂溶性维生素对于人体的健康至关重要，它们包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
这些维生素在食物中的含量不仅与人类的饮食结构有关，还与很多其他因素有关。
因此，精确测量食品中脂溶性维生素的含量对于科学合理的饮食规划和营养评估具有重要意义。
但是，传统的脂溶性维生素分析方法存在一些局限，因此科学家们一直在寻求新的分析方法来提高准确性和效率。
最近，一种新的食品中脂溶性维生素分析方法引起了科学界的关注。
这种方法基于高效液相色谱（HPLC）技术，通过测量不同脂溶性维生素的紫外吸收特性。
与传统的色谱分析方法相比，这种方法具有很多优势。
首先，它在分析过程中不需要对样品进行前处理，这大大减少了实验的复杂性和时间成本。
其次，这种方法能够同时测量多种脂溶性维生素，提高了分析效率。
最重要的是，这种方法具有较高的准确性和灵敏度，可以测量出微量的脂溶性维生素，满足了科学家对分析方法的要求。
此外，这种新方法还可以与质谱联用，提高了分析结果的准确性。
通过连接质谱仪，科学家们可以在食品中准确测量每种脂溶性维生素的含量，并在质谱图样上获得更加详细的信息，如其结构和分子量。
这种联用方法不仅可应用于食品质量监测和营养评估，还在食品加工和质量控制中起到了关键作用。
例如，在乳制品加工中，可以用该方法精确测量维生素A和维生素D的含量，确保产品符合标准。
然而，这种新方法也存在一些挑战和限制。
首先，由于分析过程中涉及到复杂的设备和技术，设备的维护和维修成本较高。
其次，这种方法对仪器操作者的技术要求较高，需要经过专门的培训和实践才能掌握。
另外，样品的预处理和前处理仍然是该方法中一个关键的环节，需要进一步改进和优化。
为了解决这些问题，科学家们正在积极开展研究，希望能够开发出更简便、高效和准确的食品中脂溶性维生素分析方法。
目前，已经有一些新的技术和方法被提出。
例如，近红外光谱法和拉曼光谱法可以非破坏性地测量食品中维生素的含量，但它们的准确性和灵敏度仍然需要进一步验证。
HPLC测定复方脂溶性维生素注射液中维生素A、E、K_1的含量
HPLC测定复方脂溶性维生素注射液中维生素A、E、K_1的
含量
陈文庆
【期刊名称】《中国药科大学学报》
【年(卷),期】1991(22)5
【摘要】复方脂溶性维生素注射液(维他利匹特注射液)是含有脂溶性维生素的白色灭菌乳剂,可作为全营养静脉输液的添加剂,以满足脂溶性维生素的每日需要。
近来有系统测定维生素的报道,但多数是报道纯品维生素的分离分析;
【总页数】2页(P311-312)
【关键词】HPLC;测定;维生素;注射液
【作者】陈文庆
【作者单位】华瑞制药有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
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注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中维生素A测定标准研究
注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中维生素A测定标准研究翟美华;朱琳【摘要】维生素A为脂溶性维生素,《中国药典》2010年版采用高效液相色谱法测定其含量,本文比较了两个注射用脂溶性维生素(Ⅱ)质量标准中维生素A的含量测定方法,两者均为反相高效液相色谱法,其结果存在较大差异,同时就对照品的使用及标准的可行性进行探讨.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2011(030)012【总页数】3页(P705-706,709)【关键词】维生素A;测定方法;质量标准【作者】翟美华;朱琳【作者单位】江苏省南通药品检验所,江苏南通226006;江苏省南通药品检验所,江苏南通226006【正文语种】中文【中图分类】R927.1注射用脂溶性维生素(Ⅱ)为维生素类药，为肠外营养组成部分，用以满足人体对维生素的生理需要，在对药品质量监控的抽样检验中发现，目前临床使用的产品存在相同名称不同规格不同标准的现象并不鲜见，同时在对维生素A的含量测定时也遇到了一些问题，现围绕标准中维生素A的含量测定与同行进行探讨.1 质量标准因检验工作需要获取了两份有关注射用脂溶性维生素(Ⅱ)的质量标准，两者之间存在较大差异(见表1).表1 两质量标准比较标准一标准二标准名称国家食品药品监督管理局标准YBH09632006国家食品药品监督管理局标准(试行)YBH38412005主药成分维生素A 0.495 mg维生素A棕榈酸酯1 940 μg维生素K1 150 μg 0.075 mg维生素E 9 100 μg 4.55 mg维生素D2 5 μg 2.5 μg维生素A测定条件对照品维生素A棕榈酸酯维生素A棕榈酸酯色谱柱填充剂辛烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶检测波长 266 nm 270 nm流动相甲醇－水(93∶7) 甲醇－乙醇(40∶60)流速1.0 mL·min －1 1.0 mL·min －1进样量10 μL 10 μL2 实验方法与结果2.1 仪器、试剂与样品 Agilent1100色谱系统;色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB －C8(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，Diamonsil C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);维生素 A 棕榈酸酯:SIGMA公司提供;甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯;注射用脂溶性维生素(Ⅱ):市场抽样A公司(样品1)及B公司(样品2、3).2.2 实验方法2.2.1 色谱条件按表1的两个色谱条件测定.2.2.2 对照溶液(参考物质溶液)的制备取维生素A棕榈酯约20 mg，置100 mL 量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得.2.2.3 供试品溶液的制备取注射用脂溶性维生素(Ⅱ)内容物适量(约相当于维生素A 棕榈酯2 mg)，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得.2.2.4 样品测定及结果取样品溶液按2.2.1色谱条件分别测定，以维生素A棕榈酸酯(标准一规定:每克维生素A棕榈酸酯相当于0.545 7 g维生素A)为参考测得两种色谱条件下的结果，见表2.改变色谱条件中色谱柱与流动相的配对情况，得到不同形状的色谱图，见表3及图1.表2 样品测定结果比较(%)标准一方法标准二方法样品187.6 62.0样品 2 82.6 41.2样品395.2 46.9表3 不同色谱柱与流动相的色谱图对比表色谱柱 C8柱 C8柱 C18柱 C18柱 C18柱流动相甲醇－水(93∶7)甲醇色谱图图1A 图1B 图1C 图1D 图1E甲醇－乙醇(40∶60)甲醇－水(93∶7)甲醇－乙醇(40∶60)图1 不同色谱柱与流动相的色谱图1.维生素E;2.维生素K1;3.维生素A棕榈酸酯;4、5.未知物质3 讨论3.1 对照品的使用维生素A棕榈酯对照品是注射用脂溶性维生素(Ⅱ)质量控制中不可或缺的标准物质(参考物质)，药品管理法规定国务院药品监督管理部门的药品检验机构负责标定国家药品标准品、对照品，国务院药品监督管理部门指定的单位即为中国药品生物制品检定所，但中国药品生物制品检定所所能提供对照品目录中没有维生素A棕榈酯.在药品监督抽验和评价性抽验检验过程中，按国家有关规定必须采用国家对照品，对于无国家对照品的检测项目，检验单位一般不检验或不对该项目做结论，如此现象会造成对药品质量监控的数据缺失而导致监管的失控，因此建议在制定药品质量标准时应考虑到对照品的因素.3.2 质量标准方面3.2.1 药品名称相同的不同或相同规格或剂型的制剂，因生产单位的不同而执行不同的质量检验标准，此类现象在我国现阶段是一个不可回避的现实，药品质量标准是保证药品检验结果正确的前提，是保证检验报告书正确、科学、严谨的关键，对于药品检验机构而言只有严格执行药品质量标准，而对标准的正确性、科学性、严谨性只能进行实验性的探讨.制定药品质量标准的目的是控制其质量，标准的制定必须遵循一个指导原则，即质量标准分析方法的验证，《中国药典》附录收载了药品质量标准分析方法指导原则，可供含量测定参考的验证内容有:准确度、精密度、专属性、线性、范围、耐用性.就耐用性而言是指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据，本次实验涉及的是并非是对质量标准进行的验证试验，而是对测定方法的探讨，因其变动的因素不仅有流动相的组成还有色谱柱类型的改变.3.2.2 本次实验两个质量标准针对的是两个规格的样品，但它们检测的主药成分是相同的(标准二中的维生素A最终也是以维生素A棕榈酸酯作为检测的参考依据).标准一处方中的维生素A按《中国药典》的要求应为维生素A醋酸酯，对于维生素A醋酸酯与维生素A棕榈酸酯在高效液相色谱中的分配行为差异未作进一步考察，但从同一份样品两种方法的检测结果看，标准一采用的色谱条件优于标准二采用的色谱条件，因从色谱图上看多一个色谱峰就说明有一个物质的存在，不考虑量的因素这也是一个质的区别.对色谱法的专属性不仅需说明诸成分的色谱位置，且要求各组分之间的分离度符合要求.3.2.3 按《中国药典》的标准规定维生素A系由维生素A醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液.维生素A醋酸酯在植物油中的溶解度较棕榈酸酯小，天然维生素A主要是全反式维生素A，尚有多种其他异构体，维生素A还因其含有多个不饱和键而导致其性质不稳定.2010年版《中国药典》对维生素A测定法进行了修订，增加了高效液相色谱法，采用的是正相色谱法，并规定维生素A醋酸酯主峰与其顺式异构体的分离度应大于3.0.本文所用标准因样品原因采用的是反相色谱法，从实验结果看，改变固定相及流动相的极性对测定结果有较大影响，辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(C8柱)的分离效果明显高于十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(C18柱)的分离效果.3.2.4 从实验的结果简单分析，影响维生素A含量测定的因素较多，样品的稳定性是必然的考虑因素，高效液相色谱系统的固定相与流动相的优化选择直接影响到实验结果的准确性，从本次实验结果看，维生素A(维生素A醋酸酯)与维生素A棕榈酸酯在相同色谱条件下色谱行为直观上的表现基本一致，但两种方法测定结果存在一定差异，需要对维生素A(维生素A醋酸酯)与维生素A棕榈酸酯在测定中的关系作进一步探讨.3.2.5 试行的药品标准超过试行期的使用也较常见，本次实验涉及的标准由生产单位提供，均为试行标准，试行期均为2年，试行开始日期分别为2005年12月15日和2006年4月28日，均已超过了标准颁布的试行期限而未有新的替代标准.3.3 小结对本次实验探讨的问题:一是制定的质量标准的科学性;二是试行标准的时效性;三是药品检验中标准物质(对照品)应用的可行性;四是同类药品标准的规范性;五是药品质量的可控性.。
RP-HPLC检测注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品含量
RP-HPLC检测注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品含量张晓宇;侯磊;陈雪艳【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2010(7)10【摘要】目的:建立注射用脂溶性维生素(Ⅱ)中间品含量快速高效液相检测方法.方法:采用Semmetry RP-C18色谱柱(4.6 mm×150mm,5μm),流动相:甲醇-水(梯度洗脱),流速:1.5 ml/min,检测波长:265 nm.结果:维生素A棕榈酸酯、维生素K1、维生素D2及维生素E浓度分别在0.144～0.216μg、0.240～0.360μg、8.000～12.000 ng、14.560～21.840 μg内呈良好的线性关系;平均回收率分别为99.74%(RSD=0.08%),98.49%(RSD=0.23%),99.83%(RSD=0.22%),99.30%(RSD =0.23%).结论:该方法简便、快捷、灵敏,能有效控制产品质量.【总页数】2页(P82-83)【作者】张晓宇;侯磊;陈雪艳【作者单位】保定三九济世生物药业有限公司,河北,保定,072656;保定三九济世生物药业有限公司,河北,保定,072656;保定三九济世生物药业有限公司,河北,保定,072656【正文语种】中文【中图分类】R927.2【相关文献】1.RP-HPLC法测定注射用右丙亚胺的含量及有关物质 [J], 吕艳芹;惠恒龙;左石2.RP-HPLC测定注射用盐酸万古霉素的含量 [J], 庄权权3.RP-HPLC法测定注射用盐酸头孢替安的含量 [J], 史春东;李占谋4.RP-HPLC法测定注射用胸腺法新中有关物质的含量 [J], 陈家香;王书兰;张海燕;吴强;林美龄;王正凤5.RP-HPLC法测定注射用磷酸氟达拉滨中磷酸氟达拉滨的含量 [J], 莫剑;宁伟志;吴秀荣;李桃;蓝忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
多种脂溶性维生素的含量测定方法[发明专利]
![多种脂溶性维生素的含量测定方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1eb1dbff55270722182ef798.png)
专利名称：多种脂溶性维生素的含量测定方法专利类型：发明专利
发明人：李鹏战,赵卫芳,王素香,程相标,吴冠勋申请号：CN201910419625.4
申请日：20190520
公开号：CN110133135A
公开日：
20190816
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了多种脂溶性维生素的含量测定方法，通过液相质谱法检测血清样本，带入标准曲线得到血清样本中的多种脂溶性维生素的含量。
对比现有检测方法，本发明的方法具有多种物质同时检测、高灵敏度、高选择性、可定性、可定量、步骤简单、适用范围广、快速准确的特点。
申请人：山东博济医药科技有限公司
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一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法[发明专利]
![一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a858591e7275a417866fb84ae45c3b3567ecddf3.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810833326.0(22)申请日 2018.07.26(71)申请人 深圳华大生命科学研究院地址 518083 广东省深圳市盐田区北山工业区综合楼(72)发明人 鲁靖睿 廖云莉 饶维桥 陈晓敏 周东生 訾金 林梁 刘斯奇 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 关畅 张立娜(51)Int.Cl.G01N 30/06(2006.01)G01N 30/88(2006.01)(54)发明名称一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法(57)摘要本发明公开了一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法。
本发明试剂盒包括脂溶性维生素校准品、同位素混合标准品、脂溶性维生素质控品、仪器质控品、流动相添加剂。
本发明采用固相支撑液液萃取法并适配自动移液站，极大的简化了样本前处理方法，结合液相色谱串联质谱法实现了高通量、快速的同时精准检测5种脂溶性维生素的目标。
本发明在检测外周血血浆样本时，大约仅需250微升血浆样本就可一次性定量5种脂溶性维生素，且由于前处理方法简单快捷，节省操作时间，根据这些指标能有效诊断和检测人体中脂溶性维生素的含量，及时预防和诊断脂溶性维生素缺乏或过量带来的疾病。
因此，本发明在临床、健康检查和科研中具有极高的应用价值。
权利要求书2页 说明书12页 附图1页CN 110763788 A 2020.02.07C N 110763788A1.一种定量检测血浆中多种脂溶性维生素的试剂盒，包括脂溶性维生素校准品、同位素混合标准品、脂溶性维生素质控品、仪器质控品、流动相添加剂；所述脂溶性维生素校准品包括系列浓度已知的由50％甲醇溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液；所述同位素混合标准品包括含量已知的视黄醇-d5、25羟基维生素D2-d6、25羟基维生素D3-d3、α-生育酚-d6、叶绿醌-d7的混合干粉；所述脂溶性维生素质控品包括浓度已知的由混合血浆溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液；所述仪器质控品包括浓度已知的由80％乙腈和0.1％甲酸溶解的视黄醇、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、α-生育酚和叶绿醌的混合溶液；所述流动相添加剂是甲酸。
脂溶性维生素的测定
脂溶性维生素的测定一、维生素A目前维生素A都是合成的，来源：从动物肝脏中得到；从维生素前体而得到维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。
对于三氯化锑比色法适用于样品中含V A高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。
对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含V A低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。
1、维生素A的性质⑴因有许多不饱和链，故见光易分解；⑵在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。
如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；⑶对碱稳定；2、测定步骤⑴样品用有机溶剂萃取脂类样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。
如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。
⑵脂类的皂化脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。
皂化条件：C2H3OH︰脂类=8︰1；KOH量=脂量×皂化价×；皂化温度与时间：70℃、30分钟在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。
⑶提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。
⑷柱层析分离干扰物质采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。
如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。
维生素A与β-胡萝卜素分离：吸附剂：8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱分离方法：a.用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素；b.用乙醚洗V A。
3、测定方法⑴SbCl3比色法维生素A／CHCl3＋SbCl3／CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。
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试验研究
SPE条件的优化
图4 脂溶性维生素用不同比例的乙醇和水的溶液溶解后在小柱上的保留能力
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
SPE条件的优化
表2 脂溶性维生素用不同有机溶剂溶解后在小柱上的保留能力
溶剂 乙腈
浓度 （%）
45
保留能力 （%）
K3
A-ac
UV：265、230 nm
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
2.52
5.2 6
13.18
17.30
20.7 0
图2 脂溶性维生素的分离色8谱.图57（流动相为乙腈:水 ＝ 98:2）
2.59
5.14
10.50
14.0 4
图3 脂溶性维生素的分离色谱图（流动相为甲醇:水 ＝ 98:2）
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实现操作简便、准确、快速、对环境污染小等特点
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技术路线
色谱条件的 摸索
样品前处理 方法
验证试验
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柱子的选择 流动相的确定 检测器，检测波长 流速，柱温，进样体积
酶解法 固相萃取法
线性 准确性和精确性
检测限
试验研究
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费时，操作复杂，结果变异大 大量有机溶剂的使用 单一或脂溶性维生素A、D、E的同步分析 ➢ 新方法的研究
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研究背景
立题依据--商品形式
➢ 维生素A
维生素A醇、维生素A棕榈酸酯、维生素A乙酸酯
➢ 维生素D3
维生素D3粉剂
➢ 维生素E
D (L)--生育酚、D (L)--生育酚乙酸酯
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试验研究
主要试剂
维生素A-ac、E-ac、E、D3、K3标准品 Savinase酶 色谱甲醇、无水乙醇 超纯水 0.2%氨水溶液 5%甲醇溶液
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试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
色谱条件
色谱柱：Atlantis dC18柱 流动相：甲醇/水 = 98/2，v/v 流速: 1 mL/min 检测器：UV，265 nm ：K3、A-ac、D3
5000 rpm 离心10 min
试验研究
净化方法
步骤
表1 固相萃取过程及作用 操作
作用
活化/平衡
1 mL甲醇/1 mL水
活化小柱
上样 淋洗 洗脱
吹至近干的提取液加入65%乙醇溶液
分析物在 柱上保留
1 mL 5%甲醇溶液
去除杂质
1 mL无水乙醇
洗脱脂溶 性维生素
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101.10
4.3
2.40
2.329 0.068
97.05
2.9
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试验研究
最低检测限
维生素 K3 A-ac D3 E E-ac
检出限（g/mL） 定量限（mg/kg）
0.075
2.5
0.06
2.0
0.06
2.0
1.20
40.0
1.26
42.0
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试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
色谱条件的优化
柱温：30、35℃ 流速：0.6 、0.8 、 1.0 mL/min 流动相：50:50、60:40、80:20、85:15、90:10、
92:8、95:5、98:2、99:1，v/v 检测波长：PAD：200-400 nm
94.60
4.8
1.00
0.876 0.076
87.64
8.6
A-ac
0.10
0.092 0.007
91.66
7.8
0.40
0.427 0.004
106.66
1.0
2.00
1.788 0.149
89.41
8.4
D3
0.02
0.021 0.002
104.64
7.5
0.24
0.234 0.005
D3
E
51.3
100.0
100.0
100.0
乙醇 甲醇
55
29.2
100.0
100.0
100.0
65
21.3
100.0
100.0
100.0
45
97.7
100.0
100.0
94.2
55
100.0
100.0
100.0
100.0
65
0
45
100.0
92.6
47.7
30.5
230 nm：E、E-ac 柱温：35℃ 进样体积：10 L
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试验研究
样品前处理
样品和碱性蛋白酶 10 mL0.2%氨水
40-50℃水浴 65 mL 40-50℃水浴 超声 20-30 min 乙醇 超声 20-30 min
乙醇 定容
上清液待用
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➢ 维生素K3
NaHSO3甲萘醌、NaHSO3甲萘醌复合物
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研究背景
O
CH3 SO3H
O
立题依据--原理
O
NH2
N
O
CH3
SO3Na
O
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O
CH3
O
研究目的
通过高效液相色谱法，建立同步检测饲料中脂溶性维 生素K3、A-ac、D3、E、E-ac的方法
R2=0.9999
R2=1
图6 脂溶性维生素的线性图
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试验研究
表3 饲料中脂溶性维生素的添加回收率（n = 5）
维生素
添加水平 （mg/g）
实测值 （mg/g）
回收率 （%）
C. V. （%）
K3
0.01
0.013 0.001
129.60
8.8
0.10
0.095 0.005
试验研究
365
254 265 292 290
图1 在PAD200-400 nm波长下的脂溶性维生素光谱图
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试验研究
样品前处理条件的优化
氨水的浓度：0.02%、0.1%、0.2% 超声提取的时间：10 、30 、60 min 超声提取的温度：40-50℃ 氨水与乙醇的比例: 10 : 90；15 : 85；20 : 80
丙酮、氯仿、乙醇、甲醇 洗脱剂的用量： 1 、2 、3 mL
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试验研究
图5 添加脂溶性维生素标样的浓缩料样品处理液 过SPE小柱前（A）和过小柱后（B）的色谱图
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试验研究
农业部饲料工业中心M A F I C
试验研究
R2=1
R2=0.9999 R2=1
97.66
2.0
1.80
1.756 0.065
97.53
3.7
E
0.08
0.079 0.004
99.33
4.9
0.40
0.403 0.013
100.74
3.3
1.60
1.662 0.048
103.88
2.9
E-ac
0.08
0.079 0.006
99.31
7.9
0.80
0.809 0.035
试验研究
主要仪器
LC-10A高效液相色谱仪（日本，岛津 SHIMADZU）包 括：脱气泵（DGU-12A）、输液泵（LC-10AT）、系 统控制器（CBM-10A）、自动进样器（SIL-10A）、柱 温箱（CTO-10A）、紫外-可见光检测器（SPD-10A）、 数据站（CLASS LC10）
Waters高效液相色谱仪：Alliance 2690，2487紫外检测 器，Masslynx软件数据系统
结论
采用高效液相色谱和固相萃取技术实现了饲料中脂溶 性维生素K3、A-ac、D3、E、E-ac的同步检测
16 min内完成脂溶性维生素的分离，回收率均在 87%-130%
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农业部饲料工业中心M A F I C
高效液相色谱法同步测定 饲料中脂溶性维生素
报告人：贺 平 丽 中国农业大学农业部饲料工业中心
2007年8月21日
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内容
➢研究背景 ➢研究目的 ➢技术路线 ➢试验研究 ➢结论
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研究背景
➢ 脂溶性维生素简介 ➢ 研究现状
常用的脂溶性维生素分析技术 ➢ 目前主要存在的问题
55
100.0
100.0
98.6
68.5
65
100.0
100.0
100.0
100.0
E-ac
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 80.5 87.9 100.0
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试验研究
SPE条件的优化
淋洗液：水、5%的甲醇溶液 洗脱剂的种类：四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯、