RNAi的机制及RNAi技术的应用

RNAi的机制及RNAi技术的应用

范怡敏,耿　飞,吴兴中

(复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系,卫生部糖复合物重点实验室,上海200032)

关键词:RNA干扰;siRNA;dsRNA;miRNA

中图分类号:Q71

文献标识码:A

文章编号:100622084(2004)0420202202

1995年,G uo和K emphues试图利用反义和正义RNA影响秀丽新小杆线虫中的par21基因表达,结果意外的发现二者同样地抑制了par21基因的表达[1]。到1998年,Fire等证实了正义RNA抑制基因表达,以及过去的反义RNA对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA 而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)[2]。RNAi现象被广泛地存在于植物、果蝇、拟南芥、斑马鱼、小鼠,甚至锥虫等大多数真核生物中,具有广阔而重要的生物学意义。1　RNAi的机制

111　RNAi的作用体现在两种水平上

11111　转录水平　RNA可以介导DNA的甲基化(RNA2direct2 ed DNA methylation,RdDM)最早发现于一种植物的类病毒系统。dsRNA(double2strand RNA)被降解成21～23个核苷酸长的小片段RNA时,这些小的RNA分子在细胞核可以诱发同源序列的DNA甲基化[3]。这种序列特异性的甲基化的信号与RNA2DNA结合有关[4]。当dsRNA含有与启动子同源的序列,即可使同源靶启动子序列甲基化,从而使靶启动子失去功能,导致下游基因沉默。非致病病毒的造成转录水平基因沉默相关的RdDM最先发现于以菜花样花叶病毒,其35S启动子转录得到含有胭脂碱合成酶启动子(NOS pro)序列的NOS pro RNA。在转基因烟草中,据报告未腺苷酸化的NOS pro dsRNA 可以诱导同源NOS pro DNA的甲基化,并使拷贝在转录水平上反式失活。在链胞霉属,DNA的甲基化可能是异染色质的siRNA介导的组蛋白H3K9的甲基化,是由H3甲基转移酶催化的[5]。

11112　转录后水平　①特异切割dsRNA的RNA酶Ⅲ家族核酸酶Dicer依赖ATP切割dsRNA,将其分解成具有2个核苷酸的3′悬端(overhang)的19～21b小片段的双链siRNA。②RISC (RNA诱导的沉默复合物RNA2induced silence complex)识别并降解mRNA。RISC是一种蛋白2RNA效应器核酸酶复合物。双链siRNA为RISC的重要组分,它依赖ATP解旋导致RISC 活化,然后通过Waston2Crick碱基配对识别底物mRNA并与之结合,并自siRNA的3′端将mRNA切割成小于12nt的片段使其降解[6]。

对一些人组织因子的试验表明,几个不同的siRNA可以攻击同一个mRNA的不同位点。只有一部分siRNA会导致显著的基因沉默,这说明在人mRNA上的siRNA结合位点可能很少,且不活跃的siRNA与活跃的siRNA可逆性竞争[7]。112　miRNA　Dicer酶产生两类功能特异的小分子RNA:siR2 NA和miRNA(micro2RNA)(图1)。Tuschl等在从果蝇胚胎提取物的长的dsRNA处理得到siRNA的同时,得到了16种20～23个核苷酸大小的短的单链RNA。这些RNA由果蝇基因组编码并在0～2周的胚胎内表达。它们具有潜在的调节基因表达的作用,被称为miRNA[8]。miRNA约21个核苷酸大小,为单链结构,大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合,它们并不改变miRNA的稳定性,而是通过抑制翻译来使基因沉默[9

],但目前至少发现一种植物miRNA(miR171)与底物mRNA 完全配对,这提示了miRNA通过RNAi途径调节基因表达的可能性[10]。与siRNA不同的是,由于miRNA为单链结构,其作用不需要ATP的存在。

图1　miRNA诱导的翻译抑制以及siRNA诱导的RNA降解

113　RNAi的放大效应　由于RNAi的机制在生物体的效应极其显著,有研究提示,RNAi通路应该有相应的放大步骤。放大效应可能的途径:①通过复制dsRNA或者siRNA进行。Nishikura提出“过渡的RNAi(transitive RNAi)”的机制,即由原先的靶序列的上游序列延伸形成新的siRNA,继续降解同源的基因家族成员或者切割mRNA[11]。②多轮的RISC效应。

③RdRP(RNA诱导的RNA多聚酶)的作用:植物和新秀丽小杆线虫的dsRNA诱导的沉默都需要与RdRP相似的蛋白质的参与[6]。RNAi一般在体细胞发挥作用,在eg o21表达的生殖细胞一种称为“随机降解PCR”的放大模型却提示RdRP通过siRNA引导链识别并结合mRNA,产生一种双链RNA的Dicer 酶底物,以产生更多的siRNA。

2　影响RNAi的因素[12]

RNAi被认为是一种有效的RNA调节方式,它受到很多因素的影响。

211　siRNA　是一种双链二聚体,有两个核苷酸的3′悬端和5′磷酸端,ATP对于siRNA5′端磷酸基团的稳定性起了重要作用[6]。

212　同源部位　与siRNA同源的启动子区[4]或编码区同源的基因,能不同程度地受siRNA抑制[12],但siRNA在动物细胞对mRNA前体没有影响,所以含非编码区序列的dsRNA不会引起RNAi。

213　siRNA的长度　据报道,siRNA以21～23nt为宜。第一个碱基通常为G,末尾两个碱基为U,悬出而不形成发夹[12]。214　G C含量　研究发现G C含量在40%～55%的siRNA在表达水平比55%以上的siRNA活性为高[12]。

215　茎区长度　对于发夹结构的双链RNA来说,茎区为9bp 的发夹能最有效地(6bp有报道)引起基因沉默[12]。

216　RNA体外转录体系　如果在体外进行RNAi试验,反应缓冲条件以及RNA合成效率对转染后RNAi的表达具有决定意义[12]。

3　RNAi的应用

3.1　用于功能基因组的研究　将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA,产生RNA干扰,使目的基因沉默,从而进一步研究目的基因的功能,这种技术即为RNAi技术。根据所选用序列的不同,可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术[4]。启动子区RNAi技术目前仅有报道对拟南芥、链胞霉等非动物细胞有效。

综合编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术的信息,可更全面地了解多基因家族各成员的功能。RNAi技术具有明显的优点,它比反义RNA技术和同源共抑制更易产生功能丧失或降低突变,且可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行。

312　治疗疾病　①HI V:Jacque等[13]发现,siRNA介导HI V病毒基因组的降解并下调基因表达。RNAi甚至在病毒基因组包含核蛋白复合体时也同样发挥作用。这为治疗HI V提供了可能的基因治疗途径。N ovina等[14]发现RNAi有对抗C D

4和其他细胞表面受体的作用,而HI V病毒正是通过这些受体进入宿主细胞,说明RNAi可以通过使C D4的表达沉默来阻断感染。②脊髓灰质炎:G itlin等[15]发现在Hela细胞里,双链短RNA减少脊髓灰质炎病毒的复制,提高被感染细胞的病毒清除率。③丙肝:K ay等通过体外试验以及在表达抗丙肝的siRNA遗传工程小鼠的实验证明,这项技术可以在体内有效的阻碍病毒复制。McCaffrey等[16]报道了siRNA抑制成年小鼠转基因表达的作用,且能作用于丙肝病毒特定序列。siRNA 用来对抗NS5B(非结构蛋白5B,病毒多聚酶编码区域)亦有效。④宫颈癌:90%以上的人宫颈癌为乳头瘤病毒阳性,不正常的细胞增殖受病毒E6和E7基因协同作用的驱使。用siRNA分别作用于mRNA使人乳头瘤病毒E6和E7基因沉默。E6沉默诱导细胞的p53蛋白,反式激活细胞周期控制基因p21控制细胞增长。HPV阴性细胞不受siRNA的影响[17]。⑤白血病:用dsRNA以M2BCRΠABL融合位点为靶位可以干扰BCRΠABL融合基因表达而抑制白血病细胞[18]。

4　结语与展望

dsRNA作为诱发同源基因沉默的反应揭示了生物学的一种新的调控模式,作为RNAi的诱发方式从体外引入合成的siRNA到质粒转染引发的内源性siRNA转录种类较多,但各有千秋,由于具有产生基因沉默的能力,RNAi技术正日益变革着当今从原虫微生物到哺乳动物的基础实验研究,被广泛应用为强有力的基因功能分析工具。随着人们对RNAi认识的逐步深入,这种技术必将具有更加广泛的应用前景。

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收稿日期:2003202220　修回日期:2003211225