双抗体夹心法

1.双抗体夹心法

双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。

其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。

操作步骤：

⑴将特异性抗体包被固相载体McAb。孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质。

⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

⑶加酶标抗体，孵育，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。

⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量。

现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体，则受检样品和酶标抗体可一次性加入，简化流程，缩短反应时间。若标本中待测抗原浓度过高，抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象)，使最终结果低于实际含量(钩状效应)，甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外，当血清中存在类风湿因子（RF）时，类风湿因子（RF）可充当抗原，而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。2.间接法

此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

操作步骤

⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相。

⑶加待检血清，孵育，使固相抗原和待检抗体充分结合，洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分。

⑷加酶标抗体或酶标SPA，孵育，形成固相抗原-待检抗体-酶标

抗抗体(或酶标SPA)复合物。

⑸加底物显色。

间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原，即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，具有更广泛的通用性。

3.竞争法

竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。其方法和特点是：①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力；②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和；③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。

操作步骤

⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体。洗涤除去未结合物。

⑵加入待检标本和酶标抗原，孵育，使两者与固相抗体竞争结合。洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物。

⑶加底物显色。颜色深浅与待测抗原量成反比。

同理，也可用固相抗原和酶标抗体作试剂，使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体。待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合，即待检抗原越多，显色越浅。

以抗原测定为例，先将特异性抗体连接于固相载体，分别设置对

照管和样品测定管；对照管中仅加酶标抗原，加样后，无非标记抗原竞争，酶标抗原即与固相抗体充分结合；而测定管抗原与后者的结合受到抑制而减少。加酶底物显色后，对照管因固相抗体上结合的酶标抗原多，显色深，测定管则依被检抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体程度不同而显色深浅有异：被检抗原多，酶标抗原与固相抗体结合少，底物显色反应弱，色浅；反之呈色深。即结合于固相的酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相关。计算测定管与对照管颜色深度（OD值）之差，即可确定被检抗原量。

4.捕获法

捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。因此捕获法的工作原理设计为：先将针对IgM的第二抗体（如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤出去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。

5.其他ELSA

ELSA法由于测定灵敏、特异、操作简便、易于自动化，且无放射性污染等诸多优点，使其不仅成为目前应用最广而且发展最快的一种免疫测定技术。而且在方法学上的改进和衍化，使其不断有各具特

点的新测定法问世，如应用生物素-亲和素放大系统（biotin-axidin system，BAS）的ELISA；利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（enzyme linked immunofluorecence assay，ELFIA），斑点-ELISA （dot-ELISA）和酶联免疫电转移印迹法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB）以及酶联免疫化学发光测定（enzyme linked immunochemiluminescence assay，ELICLA）等。新方法不仅进一步提高了测定灵敏、特异性，而且使ELISA技术在提高自动化程度的同时，也便于单份样本测定和简化设备条件，尤其试用于急诊、社区诊所及家庭化验。

膜载体的酶免疫测定

固相膜免疫测定（solid phase membrane-based immuoassay ）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似，其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有色微粒子，如彩色乳胶、胶体金、胶体硒等，以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了两种不同类型的快速检测方法。常用的固相膜为硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜。

㈠斑点酶免疫吸附试验

斑点-ELISA（dot-ELISA）实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC 染色实验方法为：加少量（1~2μl）抗原于膜上，由于NC膜吸附能