比色分析法和分光光法的实验操作法

内容
1 比色分析法和分光光度法 2 比色分析的测定方法
3
3 分光光度计的基本结构与使用 4 蛋白质的含量测定
比色分析法和分光光法的实验操作法
比色分析法
• 概念：用比较溶液颜色深浅来确定溶液中 有色物质含量的方法
比色分析法和分光光法的实验操作法
分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。
Akcl
当I 0时，lg I0 值无穷大，表示光线乎几被溶液完全吸收，溶即液不透光。 I
由此可见，lg I0 表示溶液对光吸收的度程，称作吸光度a（bsorbanc）e ， I
用A表示，即A lg I0 I
比色分析法和分光光法的实验操作法
It／I0 ＝ T
T （ transmittance ）称为透光度 ，表示透过光的强度是 入射光强度的百分比。
• 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能， 提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进 行所有的实验。
• 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术， 尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加 科研工作打下坚实的基础。
比色分析法和分光光法的实验操作法
注意事项
• 不许迟到早退。 • 上课必须穿白大衣。 • 实验室内禁止吃东西。 • 未经允许，不得随意动实验器材。 • 实验后认真打扫卫生。 • 按时上交实验报告册。 • 遇到问题及时沟通。
入射光
I0
反射光
吸收光
Ir Ia 比色分析法和分光光法的实验操作法
I 出射光
t
分光光度法的原理
• Lambert定律
入射光强度 I0
透光率T I I0
C
I 透过光强度
L 液层厚度
lg Io k l I
比色分析法和分光光法的实验操作法
分光光度法的原理
• Beer定律
入射光强度 I0
C
I 透过光强度
A= - IgT = KCL
A （Absorbance）称为吸光度，指溶液对光线的吸收程度又 称为光密度（Optical density， OD ）。
A∝C 光密度与浓度成正比
T与C成反比，浓度愈大，T愈小
比色分析法和分光光法的实验操作法
比色分析的测定方法 一、波长的选择标准：吸收MAX 干扰MIN 比色分析法和分光光法的实验操作法
二、待测溶液浓度的计算方法
1.利用标准管计算测定物的含量 2.利用标准曲线计算测定物含量 3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度
比色分析法和分光光法的实验操作法
利用标准管计算测定物的含量
在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测 定末知浓度（CU）的吸光度（AU），
比色分析法和分光光法的实验操作法
/nm
400450
450-
绿 黄
青
480 480-
490
490-
橙
Baidu Nhomakorabea白光
青蓝
500
500-
560
红
蓝
560-
紫
580
580610
610-
不同颜色的可见光波长及其互 650
补光
650比色分析法和分光光法的实验操76作0法
颜色 紫
互补光 黄绿
蓝
黄
绿蓝
橙
蓝绿
红
绿
红紫
黄绿
紫
黄
L 液层厚度
lg Io k c I
比色分析法和分光光法的实验操作法
分光光度法的原理
• Lambert-Beer定律
lg Io k l ＋ lg Io k c ＝ lg Io kcl
I
I
I
公式的意义：
当I I0时，lg
I0 I
0，表示溶液完全不吸光收线；
当I＜I0时，lg
I0 I
值大，表示溶液吸收线光较多；
蓝
橙
绿蓝
红
蓝绿
分光光度法的原理
• Lambert-Beer定律（光吸收定律） • 溶液的质量浓度（C）越大，液层厚度（L）越厚，则溶
液对光线吸收得越多。 当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即K吸光
系数为定值），溶液对光线的吸收与溶液中吸光物质的浓度 成正比。
所以可通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。
若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通 过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质 测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得 测定物的浓度。
比色分析法和分光光法的实验操作法
对末知浓度 物质测定时 ，无需再作 标准管，据 测定管吸光 度从标准曲 线上即可求 得测定物的
• 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、 快速。对于复杂的组分系统，无须分离 即可检测出其中所含的微量组分的特点。
比色分析法和分光光法的实验操作法
基本原理
一.光由几部分组成：3部分
比色分析法和分光光法的实验操作法
二、物质对光的选择性吸收
1、光的互补性与物质的颜色
单色光：只具有一种波长的光。 混合光：由两种以上波长组成的光，如白光。
生物化学实验
Biochemical Experiment
实验一 比色分析法和分光光度法
比色分析法和分光光法的实验操作法
通过生物化学实验应该做到
• 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验 的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合 理地安排实验步骤和时间。
• 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生 物化学实验仪器。
比色分析法和分光光法的实验操作法
成绩
• 理论课（80）+实验课（20）=100分。 • 实验课（20） =(报告册+课堂表现)（10）+考试成绩
（10）。 • 报告册：书写的认真情况，对实验中出现的问题分析
和看法的总结等。 • 课堂表现：是否有迟到早退现象，注意听讲，打扫卫
生等。
比色分析法和分光光法的实验操作法
可见光分为哪几个单色光？
绿 黄
青
橙
白光
青蓝
红
蓝
紫
比色分析法和分光光法的实验操作法
物质的颜色是由于物质对不同波 长的光具有选择性的吸收作用而 产生的，物质的颜色由透过光的 波长决定。
例：硫酸铜溶液吸收白光中的黄色光而呈蓝色； 高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。
如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以 得白光，这两种光就叫互为补色光。物质呈现的颜色和 吸收的光颜色之间是互补关系。
根据定律得：Au KuCuLu As KsCsLs 因为：Ku Ks Lu Ls
所以As与Au之比值也等于两浓度之比值 即 Au Cu
As Cs Cu Au Cs
As
比色分析法和分光光法的实验操作法
利用标准曲线计算测定物含量
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光 度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标， 在方格坐标纸上作图。