实验三细胞化学成分显示
【2019年整理】实验三苏丹
实验三苏丹Ⅲ染色法染小鼠肠系膜脂肪细胞【实验目的】熟悉脂肪显示技术, 了解脂肪在脂肪细胞中的分布用苏丹Ⅲ染液对小鼠的肠系膜细胞染色, 观察细胞颜色, 掌握苏丹Ⅲ染液的染色方法。
【实验原理】脂类包括的范围很广, 有单纯脂、复合脂、衍生脂等, 脂肪依其性质可分中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、髓磷脂以及其他类脂质。
通常, 各种脂与类脂质在体内不是单独存在, 是以某种程度混合存在。
脂肪于类脂质和蛋白质结合时, 往往不易显出, 但用重铬酸钾、升汞、硝酸钴或硝酸铀氧化组织块或切片, 可以显现出脂肪及类脂类。
脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质, 根据其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。
很多细胞都含有脂肪, 游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内, 比较显著的如肝细胞。
脂肪小滴可以集合, 将细胞质及细胞核挤到一旁, 如脂肪细胞。
脂类不溶于水, 易溶于酒精、苯、乙醚、氯仿。
因此脂肪标本的制作, 需要不含酒精或不能溶脂的液体固定。
一般常用甲醛类固定剂。
其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。
脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类, 使用时, 注意选择溶剂, 要求既要溶解苏丹染料, 又不溶掉脂肪。
其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。
脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类, 使用时, 注意选择溶剂, 要求既要溶解苏丹染料, 又不溶掉脂肪。
苏丹Ⅲ的70%酒精饱和液或丙酮和70%酒精等量饱和液, 可将脂肪染为橙红色。
用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体, 可用于石蜡切片。
脂肪标本一般不用石蜡切片或火胶棉包埋, 而用如下方法。
冰冻切片, 明胶包埋冰冻切片, 铺片法。
脂肪细胞主要是贮存脂肪, 而脂肪组织主要是由脂肪细胞组成, 从而贮存能量。
主要由两种脂肪组织, 白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）, 它们是由两种不同的脂肪细胞组成, 在小鼠的肠系膜中主要是WAT。
实验三 荧光显微镜化学测定和细胞活性测定
思考
一．实验目的 二．实验原理 三．实验用品 四．实验方法
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实验目的
• 学习荧光显微镜的使用 • 了解荧光显微技术原理和方法 • 荧光技术在细胞化学学习方面的应用
• 掌握细胞活力测定的方法 • 学习辨别细胞的死活
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实验六
实验原理
• 荧光显微镜是用于检测显微镜尺度下 荧光信号的显微镜。活性物质受到光 照或其他形式的能量后释放出其中一 部分以光为形式的能量的现象被称为 荧光现象这样的活性物质称为荧光物 质 • 荧光可以分为自发荧光和次生荧光。 有些生物体受到短波光照射时直接发 出荧光。
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物镜
• 由于激发标本和收集荧光都是由同一物镜 来实现的，所以物镜是能透过紫外光的特 制物镜，荧光效率与所用的物镜的数值孔 径的4次方成正比，所以用数值孔径较大的 浸液物镜的效果更好。
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目镜
• 荧光亮度与目镜放大倍数的平方成反比。
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荧光技术是生命科学研究的重要手段。 1. 荧光显微镜对细胞凋亡的形态学观察 2. 流式细胞术检验细胞特性 3. 荧光技术在微丝骨架研究中的应用 4. 荧光原位杂交的应用 5. 绿色荧光蛋白在动物细胞分子生物学中的 应用 6. 免疫荧光抗体的制备
可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜 下核呈绿色，细胞质呈黄色。 与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发 出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光， 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料 具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA 染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透 过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧 光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大 小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上 致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而 坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
实验三 细胞吞噬及ACP染色
用低倍镜观察！用高倍镜观察， 必须加盖玻片！
五、预期的实验结果（见指导书彩图19、20）
细胞吞噬：在10倍镜下可见四膜虫在不 停游动，吞噬碳粒。过一段时间后整个 细胞呈现黑色，经亮绿处理后观察细胞 中可见大小不同的黑色碳粒。
酸性磷酸酶染色中，样本片中出现大小 不同的小泡或斑块，呈棕色或棕黑色， 即酸性磷酸酶所在的位置。对照片中细 胞呈淡黄褐色，无吞噬泡形成的迹象。
4．3000rpm 离心1分钟，谨慎取出离心管，不要 晃动液体，迅速吸取上清100μl （沿离心管侧壁从 上往底部吸取，小心不要搅动底部的沉淀物）， 将这100ul豆奶液弃入水槽。然后吸取余下100ul液 体，对着底部沉淀缓慢吹打，如此反复几次，将 沉淀悬浮于所剩的100ul豆奶液中。（此步是通过 低速离心浓缩四膜虫，去除一半体积的豆奶后， 四膜虫在余下100ul的豆奶中有较大的浓度）
2．明确酸性磷酸酶(Acid phosphatase ) 与溶酶体的关系，理解溶酶体的生 理意义。
3. 掌握酶细胞化学技术中Gomori法的 原理和基本操作。
二、实验原理
1. 细胞的胞吞作用（endocytosis） 2. 溶酶体 （lysosome ） 3. 酶细胞化学
1. 细胞的胞吞作用
真核细胞内穿梭着各种膜性囊泡，按照运动的方向， 分为两种途径：
7. 取一片标本做记号，于100℃干烤10分钟（使酶 失活，对照组）。另一片（实验组）置于室温。
8．将标本片放入酶作用液的染色缸中，将染色缸 置于37℃水浴，20分钟。（一组四片）
9．水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。
10．将标本片放入0.2% (NH4)2S中，反应1分钟。 11．自来水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。
细胞生物学实验三细胞骨架显示
细胞骨架定义
• 细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的
蛋白纤维网架体系。
• 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、
细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指 细胞质骨架，包括微丝（microfilament，MF）、 微管（microtubule，MT）、中间纤维 （intermediated filament，IF）。
用品与试剂
• 用品略。
实验步骤
A、动物细胞的微丝观察
1）将细胞培养在盖玻片上。取出盖玻片，用PBS洗3次。 2）室温下用1%TritonX-100（ M-缓冲液配）处理20-30 min。 3）用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。 4）用3.0%戊二醛（ M-缓冲液配）固定细胞10 min。 5）用PBS洗3次，滤纸吸干。 6）用0.2%考马斯亮蓝R250染片子30 miitonX－100、 3.0%戊二
醛均用PBS配观察实验效果。
改变后的操作
1）撕取洋葱鳞茎内表皮若干片（约1cm2），放入盛有0.2mol/L的磷 酸盐缓冲液（pH 6.8）的小烧杯中2－3min。
2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100（PBS配）处理20 min。 3）吸去TritonX-100，用PBS充分洗3次，每次5min。 4）加3.0%戊二醛（PBS配）固定30 min。 5）用PBS洗3次，每次5min，滤纸吸去残留液体。 6）0.2%考马斯亮蓝R250染色10 min。 7）用蒸馏水洗数遍，降低背景。 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。
实验报告及思考题
1 画出所观察到的洋葱细胞骨架图像。 2 说明在实验中1%TritonX-100处理细胞
的作用是什么？ 3 说明M-缓冲液的作用是什么？比较改变
细胞生物学实验(本科生)实验内容
细胞生物学实验（本科生）实验内容实验一细胞的结构目的：1、熟悉实验室规范2、掌握光镜下细胞器的形态、分布特点；3、掌握临时制片法；4、学会生物绘图内容：（一）录像：临时标本片的制作（二）光镜下细胞器形态学观察：1、高尔基体（兔神经节切片）2、细胞核及核仁（蝾螈表皮装片）3、线粒体（肾小管切片）4、细胞骨架（培养肝癌细胞飞片）5、中心体*（马蛔虫受精卵切片）（二）操作：制作人口腔上皮细胞临时制片（显示活体线粒体）（三）实验报告：绘制人口腔粘膜上皮细胞实验二细胞化学细胞工程目的：1、掌握甲基绿-派洛咛染色法原理及操作技巧2、了解几种化学成分的显示方法及原理；3、观察各种化学成分在细胞中的分布；4、了解PCC原理；5、了解细胞融合及其应用；内容：（一）录象：克隆羊（二）观察：1、糖原（动物肝切片，PAS反应）2、酸性蛋白（蟾蜍血涂片，酸性固绿染色）3、酸性磷酸酶*（鼠腹腔液涂片，金属沉淀法显色）4、DNA* （小鼠睾丸切片，Feulgen反应）5、DNA、RNA*（人口腔粘膜上皮细胞涂片，吖啶橙染色，荧光显微镜观察）6、细胞融合（鸡血细胞、培养细胞）7、PCC*（Hela细胞）（三）操作：制作蟾蜍血涂片，显示DNA、RNA（四）实验报告：甲基绿-派洛咛染色原理、步骤及结果实验三显微测量细胞的生理活动目的：1、掌握显微测量技术；2、观察细胞的生理活动；3、掌握死活细胞的鉴别方法及原理；内容：(一)录象：细胞的活动显微测量（二）观察：1、胞质环流（黑藻叶片）2、吞噬作用*（小鼠白细胞）3、吞噬作用（蟾蜍白细胞）（三）操作：1、显微测量（蟾蜍红细胞）2、死活细胞鉴别（酵母细胞）（四）实验报告：1、测量5-10个细胞的大小，计算平均值；2、计算细胞存活率。
实验四细胞增殖染色体（质）目的：1、熟悉细胞增殖的主要方式；2、掌握细胞增殖周期各期的形态学特点；3、熟悉人染色体的基本形态特征；4、掌握X染色质标本的制备方法及原理；内容：（一）观察：1、动物细胞有丝分裂（马蛔虫受精卵切片）2、植物细胞有丝分裂（洋葱根尖纵切片）3、收缩环*（肝癌细胞飞片）4、无丝分裂*（草履虫装片）5、人染色体的基本形态（人血涂片）（二）操作：1、制作有丝分裂压片（洋葱根尖）2、制作X染色质标本片（人口腔粘膜上皮细胞）（三）实验报告：绘有丝分裂图、X染色质图。
实验三细胞器及细胞骨架的观察总结
作业： 绘人口腔黏膜上皮细胞图和藻叶细胞图
3）中心体的观察 取马蛔虫子宫切片，在低倍镜下寻找其受精卵分裂中期的细胞， 然后换高倍镜观察，可见中期细胞中央有深蓝色条状的结构，这就 是染色体。在染色体两侧，各有一深蓝色的圆形小粒，即中心粒。 在中心粒周围的致密物质叫做中心球。中心粒和中心球构成中心体， 在中心体周围还可看到许多纤细的、呈辐射状分布的星射线。中心 体和星射线合称星体。有时因切面的关系，中心体仅出现在一侧或 两侧均无（该过程由教师示教)
实验三 细胞器及细胞 骨架的观察
一、实验原理
（一）细胞器的观察
光学显微镜由于分辨率较低，一般用于观察细胞的结构。细胞器 的结构主要在电子显微镜下观察，称为细胞的亚微结构。有一些特殊 细胞内的部分细胞器，可以直接在光镜下观察到（如叶绿体)，有些 通过特殊组织化学或组织免疫化学染色，能清晰的在光镜下显示。
1、用镊子撕取洋葱鳞叶内表皮若干片约lcm2大小，放入小烧杯 或小培养皿中，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2) 洗3 次，每次约 0.5 min。 2、吸去PBS，用1％TritonX-100，37℃处理洋葱表皮20～30 min. 3、除去TritonX-100，用M-冲液充分洗3次，每次约2 min，以 使细胞骨架的稳定。 4、 加3.0％戊二醛固定10 min。
二、实验目的
1、观察动植物的各种细胞器。通过特殊组织化学或组织免疫化学染色， 了解细胞器结构。 2、了解洋葱鳞叶内表皮细胞内细胞质骨架的分布 3、能正确的绘图，并记录观察结果，并能理解每个实验步骤的意义
三、实验材料及仪器
(1)器材：光学显微镜、解剖镊、解剖针、手术剪、载玻片、盖玻片、吸管、 吸水纸、擦镜纸、小平皿、恒温培养箱、、1ml取液器、染色缸 。 (2)材料：洋葱鳞叶、脊神经节切片、小白鼠十二指肠横切片。 (3) 试剂：PBS缓冲液（PH=7.2）、1% TritonX-100、M-缓冲液、3.0%戊二 醛、0.2%考马斯亮蓝R250
第3讲 构成细胞的基本物质
（五）蛋白质:有生物活性的有机高分子化合物 1.蛋白质的结构
C、H、O、N（P：与其他成分结合、S：可以全由 元素组成： 氨基酸组成）
基本单位 --------- 氨基酸
脱水缩合
化学结构 ---------
多肽
盘曲折叠
空间结构 --------蛋白质(高分子化合物）
氨基酸的结构通式：
R H2N C H
Mg
植物体缺Mg会影响光合 作用，为什么？
叶绿素分子（局部）
Fe2+是血红蛋白分子的重要组成部分，缺乏会 导致缺铁性贫血。
地方性甲状腺肿患者
（三）糖类 1.组成元素：C、H、O 2.分类和功能：课本P56 糖类是细胞生命活动的主要能源物质。
（1）单糖：不能再水解的糖，可直接被细胞吸收。
种类 六碳糖 实例 葡萄糖（C6H12O6)、 果糖、半乳糖等 功能 葡萄糖是细胞应用最广泛、普遍 的能源物质，常被形容为“生命 的燃料”
（二）无机盐
课本P50
1.含量:很少,约占总鲜重的1～1.5%。 2.存在形式:大多数是离子状态，少数是化合物 状态。 3.主要生理作用: ①是复杂化合物的重要组成部分（结构成分） ②对于维持生物体生命活动有重要作用 ③维持细胞的渗透压平衡 ④调节生物体内或细胞的酸碱平衡
血浆中Ca2+含量太低，哺乳动物会出现抽搐的 现象。
派洛宁与RNA亲和力高，使RNA显示红色。
二、实验过程：略
三、实验结果：细胞核-绿色-DNA
细胞质-红色-RNA
（六）核酸:有生物活性的有机高分子化合物 2.核酸的结构
元素组成 ---------C、H、O、N、P 基本单位 ---------核苷酸
化学结构 ---------核苷酸链
《细胞生物学》教学大纲
《细胞生物学》教学大纲一、课程基本信息课程名称：（中文）：细胞生物学（英文）：Cell Biology课程代码：09S5118B课程类别：专业核心课程适用专业：生物科学（检验与检测方向）课程学时：48课程学分：3先修课程：动物生物学、植物生物学、生物化学等选用教材：丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国主编，《细胞生物学》（第5版），北京：高等教育出版社，2020，5参考书目：1. 翟中和、王喜忠、丁明孝主编，《细胞生物学》（第4版），北京：高等教育出版社，2011，62. 王金发主编，《细胞生物学》，北京：科学出版社，2018，2二、课程简介《细胞生物学》课程是高等学校生物专业的必修课程，综合运用各种现代科学技术，从细胞水平，亚细胞水平和分子水平上全面系统地研究细胞生命活动规律的科学。
细胞生物学是生命科学中的一门重要前沿学科，作为四大基础学科之一，也是基础医学领域的重要基础学科，在现代生命科学领域中起着不可替代的重要作用。
通过学习该课程后，使学生掌握细胞生物学的基本理论、基本知识和基本技能，了解细胞的形态结构、功能与生命活动的基本规律以及该领域的最新发展动态，建立细胞生物学的知识脉络和体系，培养学生生物学的科学思想，从而使学生能够从细胞的角度去理解生命。
本课程总学分为3，共48学时，授课对象为生物科学（检验与检测方向）专业大三学生。
三、课程目标通过本课程的学习，使学生具备以下知识、技能和素养。
1.知识目标：能初步了解细胞间的相互关系和作用，理解生物有机体的生长、分化、遗传、变异、衰老、死亡等基本生命活动的规律；掌握遗传信息的贮存、复制、表达及其调控；认识细胞生物学与生物化学、遗传学、分子生物学、动物生物学等的联系。
2.能力目标：增强细胞生物学研究兴趣，善于对细胞生物学现象进行观察和思考，提高应用细胞生物学知识进行教育教学研究的能力；学会收集和分析细胞生物学问题，初步了解如何进行细胞生物学科学研究，为进一步的生命科学前沿知识的学习或从事生命科学教学科研相关研究奠定基础。
细胞生物学实验本科生实验内容
细胞生物学实验（本科生）实验内容实验一细胞的结构目的：1、熟悉实验室规范2、掌握光镜下细胞器的形态、分布特点；3、掌握临时制片法；4、学会生物绘图内容：（一）录像：临时标本片的制作（二）光镜下细胞器形态学观察：1、高尔基体（兔神经节切片）2、细胞核及核仁（蝾螈表皮装片）3、线粒体（肾小管切片）4、细胞骨架（培养肝癌细胞飞片）5、中心体*（马蛔虫受精卵切片）（二）操作：制作人口腔上皮细胞临时制片（显示活体线粒体）（三）实验报告：绘制人口腔粘膜上皮细胞实验二细胞化学细胞工程目的：1、掌握甲基绿-派洛咛染色法原理及操作技巧2、了解几种化学成分的显示方法及原理；3、观察各种化学成分在细胞中的分布；4、了解PCC原理；5、了解细胞融合及其应用；内容：（一）录象：克隆羊（二）观察：1、糖原（动物肝切片，PAS反应）2、酸性蛋白（蟾蜍血涂片，酸性固绿染色）3、酸性磷酸酶*（鼠腹腔液涂片，金属沉淀法显色）4、DNA* （小鼠睾丸切片，Feulgen反应）5、DNA、RNA*（人口腔粘膜上皮细胞涂片，吖啶橙染色，荧光显微镜观察）6、细胞融合（鸡血细胞、培养细胞）7、PCC*（Hela细胞）（三）操作：制作蟾蜍血涂片，显示DNA、RNA（四）实验报告：甲基绿-派洛咛染色原理、步骤及结果实验三显微测量细胞的生理活动目的：1、掌握显微测量技术；2、观察细胞的生理活动；3、掌握死活细胞的鉴别方法及原理；内容：(一)录象：细胞的活动显微测量（二）观察：1、胞质环流（黑藻叶片）2、吞噬作用*（小鼠白细胞）3、吞噬作用（蟾蜍白细胞）（三）操作：1、显微测量（蟾蜍红细胞）2、死活细胞鉴别（酵母细胞）（四）实验报告：1、测量5-10个细胞的大小，计算平均值；2、计算细胞存活率。
实验四细胞增殖染色体（质）目的：1、熟悉细胞增殖的主要方式；2、掌握细胞增殖周期各期的形态学特点；3、熟悉人染色体的基本形态特征；4、掌握X染色质标本的制备方法及原理；内容：（一）观察：1、动物细胞有丝分裂（马蛔虫受精卵切片）2、植物细胞有丝分裂（洋葱根尖纵切片）3、收缩环*（肝癌细胞飞片）4、无丝分裂*（草履虫装片）5、人染色体的基本形态（人血涂片）（二）操作：1、制作有丝分裂压片（洋葱根尖）2、制作X染色质标本片（人口腔粘膜上皮细胞）（三）实验报告：绘有丝分裂图、X染色质图。
南开大学细胞生物学实验-实验三细胞化学—联苯胺反应
实验用显色反应
联产生苯新胺生反氧应,：后过者氧再化将物无酶色分的解联H苯202胺。 氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化 合物。
实验内容和目的
通过联苯胺反应, 掌握过氧化物 酶的显示方法及联苯胺反应原理
概述
显示过氧化物酶的联苯胺反应
超氧化物歧化酶（SOD） 、过氧化物酶 （POD）和过氧化氢酶（CAT）是构成机 体防御脂质过氧化系统的内源成分，它 们构成了生物体内重要的酶促反应防御 体系，从而维护生物体内细胞正常的生 理代谢和生化反应。
实验原理
显示过氧化物酶的联苯胺反应
细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化 为蓝色（或棕色）产物。因而,可根据 颜色反应判断酶的有无或多少。 联苯 胺被氧化后，脱下的H再与H2O2作用生 成水。 为了验证实验的准确性可用煮 沸杀死组织法,或用呼吸抑制剂抑制酶 的活性。
0.85% 生理盐水洗1min ↓
10% 甘油封片 ↓
镜检
油菜叶柄徒手切片
实验结果
蓝色沉淀指示有过氧化物酶存在。 注意观察细胞内蓝色沉淀的存在 部位，大小，形状和数量。
实验结果
实验报告要求
摘要及关键词 实验原理 材料和方法 结果与分析苯胺反应
(必做，综合性实验，4学时）
前言
细胞化学染色 （cytochemical staining）是 利用染色剂可同细胞的某种成分发生反 应而着色的原理，对某种成分进行定性 或定位研究的技术。利用这种方法对细 胞的各种成分几乎都能显示，包括有无 机物、 醛、 蛋白质、糖类、脂类、核 酸、酶等。
常用显色反应
实验三细胞化学—联苯胺反应
常用显色反应
金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色 沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分 解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉 淀，而显示出酶活性。 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成 耐晒染料。 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成 普鲁士蓝。 Formazane反应：显示脱氢酶。 “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。
实验三
细胞化学染色 —联苯胺反应
(必做，综合性实验，4学时）
前言
细胞化学染色 （cytochemical staining）是 利用染色剂可同细胞的某种成分发生反 应而着色的原理，对某种成分进行定性 或定位研究的技术。利用这种方法对细 胞的各种成分几乎都能显示，包括有无 机 ↓ 徒手切片→ 0.85% 生理盐水1000 c 5-10 min 对照 ↓ 0.85% 生理盐水 3-5min ↓ 0.1% 钼酸胺 5 min 后吸干 ↓ 联笨胺溶液（1滴 H2O2/2ml 联笨胺，摇动至显示兰色) ↓ 0.85% 生理盐水洗1min ↓ 10% 甘油封片 ↓ 镜检
实验原理
显示过氧化物酶的联苯胺反应
细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化 为蓝色（或棕色）产物。因而,可根据 颜色反应判断酶的有无或多少。 联苯 胺被氧化后，脱下的H再与H2O2作用生 成水。 为了验证实验的准确性可用煮 沸杀死组织法,或用呼吸抑制剂抑制酶 的活性。
实验材料及试剂
材料：油菜叶柄 试剂：生理盐水； 0.1%钼酸铵; 联苯胺; 10% 双氧水; 10%甘油
实验用显色反应
细胞生物学(翟4版)复习提纲
一、线粒体的基本形态及动态特征 二、线粒体的超微结构 三、氧化磷酸化 四、线粒体与疾病
外膜、内膜、膜间隙、基质的标志酶； 电子传递链四种复合物的名称和作用； 氧化磷酸化；化学渗透假说的内容；ATP 合酶及其机制； 电子传递体、质子移位体、Q 循环
第二节 叶绿体与光合作用
一、叶绿体的基本形态及动态特征 二、叶绿体的超微结构 三、光合作用
第五节
其他细胞表面受体介导的信号通路
一、Wnt-β-catenin 信号通路 二、Hedgehog 受体介导的信号通路 三、NF-κB 信号通路 四、Nctch 信号通路 五、细胞表面整联蛋白介导的信号转导
第六节
细胞信号转导的整合与控制
一、细胞的应答反应特征 二、蛋白激酶的网络整合信息 三、信号的控制：受体的脱敏与下调
第二节
细胞质膜的基本特征与功能
一、膜的流动性 二、膜的不对称性 三、细胞质膜相关的膜骨架 四、细胞质膜的基本功能
3
流动镶嵌模型、脂筏模型、膜脂的成分与运动方式、脂质体 膜蛋白的类型、膜蛋白与膜脂结合的方式、成斑和成帽现象 膜骨架的概念、血影蛋白、血型糖蛋白、带 3 蛋白 —————————————
一、内质网 二、高尔基体 三、溶酶体 四、过氧化物酶体
2 种类型内质网、微粒体、肌质网；内质网的功能； 磷脂转位因子与磷脂转换蛋白、N-连接与 O-连接糖基化的比较、 KDEL 序列、极性细胞器、 糙面内质网------蛋白质的合成、修饰与加工； 光面内质网------脂类的合成与转运； 高尔基体------糖类合成； 溶酶体------细胞内消化； 异质性细胞器、溶酶体膜的特征 初级溶酶体、次级溶酶体、自噬溶酶体、异噬溶酶体、残余小体 初级溶酶体与过氧化物酶体的特征比较 过氧化物酶体的功能 内质网的标志酶是葡萄糖-6-磷酸酶，高尔基体的标志酶是糖基转移酶， 溶酶体的标志酶是酸性磷酸酶，过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶。 —————————————
实验三细胞骨架的显示和观察
细胞内由微丝、微管、中间纤维等交织 形成一个十分复杂的立体网络结构。它 们对于细胞形状的保持、细胞内物质运 输、细胞运动、细胞内各结构相对位置 的固定，故而称为细胞骨架；
对生长、分裂、分化，物质运输、能量 转换、信息传递、基因表达都有重要作 用。
实验目的 ： 1.了解细胞骨架的结构特征 2.掌握光镜标本的细胞骨架的制作方法。
实验仪器：显微镜、盖玻片、载冲液、1%TritonX-100、M-缓冲 液、0.2%考马斯亮蓝R250染液、3%戊二醛
标本：玉葱鳞叶
实验原理
细胞骨架在通常固定条件下不稳定，如低温、 高压、酸处理等。
当采用适当的手段，如当洋葱表皮细胞用适当 浓度的Tritonx——100(聚乙二醇辛基醚，是一 种非离子去垢剂)处理，能溶解质膜结构中及 细胞内许多蛋白质，细胞骨架系统的蛋白质却 不被破坏，
3、与抗原、抗体的结合方式简便，
不影响抗原或抗体的效价；
4、荧光明亮、不易淬灭； 5、性质比较稳定，易溶水。
荧光免疫染色类型： 直接、间接和补体介导
用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片)
思考题
1. 细胞分裂时细胞骨架发生哪些改变？ 可以采取哪些研究方法进行检测？
实验结果
细胞内有蓝色、粗细不均的纤维网状结 构，即为细胞骨架。
细胞生物学实验技术简介
免疫荧光染色显示细胞骨架
免疫荧光染色（Fluorescence immuno-staining）是利 用抗原－抗体特异性结合的原理，用经荧光染料标记的抗体 对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。该技 术与荧光显微镜观察相结合，可对特定的蛋白质进行细胞或 组织内的精确定位。近年来随着各种新基因和新蛋白的发现， 免疫荧光染色技术也得到越来越广泛的应用，免疫荧光技术 本身也不断得到改进。
实验三 苏丹
实验三苏丹Ⅲ染色法染小鼠肠系膜脂肪细胞【实验目的】1、熟悉脂肪显示技术，了解脂肪在脂肪细胞中的分布2、用苏丹Ⅲ染液对小鼠的肠系膜细胞染色，观察细胞颜色，掌握苏丹Ⅲ染液的染色方法。
【实验原理】脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等，脂肪依其性质可分中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、髓磷脂以及其他类脂质。
通常，各种脂与类脂质在体内不是单独存在，是以某种程度混合存在。
脂肪于类脂质和蛋白质结合时，往往不易显出，但用重铬酸钾、升汞、硝酸钴或硝酸铀氧化组织块或切片，可以显现出脂肪及类脂类。
脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。
很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。
脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。
脂类不溶于水，易溶于酒精、苯、乙醚、氯仿。
因此脂肪标本的制作，需要不含酒精或不能溶脂的液体固定。
一般常用甲醛类固定剂。
其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。
脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。
其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。
脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。
苏丹Ⅲ的70%酒精饱和液或丙酮和70%酒精等量饱和液，可将脂肪染为橙红色。
用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片。
脂肪标本一般不用石蜡切片或火胶棉包埋，而用如下方法。
冰冻切片，明胶包埋冰冻切片，铺片法。
脂肪细胞主要是贮存脂肪，而脂肪组织主要是由脂肪细胞组成，从而贮存能量。
主要由两种脂肪组织，白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT），它们是由两种不同的脂肪细胞组成，在小鼠的肠系膜中主要是WAT。
细胞内化学成分的检测实验优秀文档
2、材料中不含有对实验结果产生影响的其他有色的物 不1、同选物用质的与实特验定材的料化含学有试相剂关的物特质定且显量色高反。应。
三不、同实 物验质的与共特性定操的作化过学程试：剂的特定显色反应。
物质检测类实验总结：
一、实验的共性原理：
生物组织中成分的不检测同实验物质与特定的化学试剂的特定显色反应。
三、实验的共性操作过程：
材料切薄二片后、染色实，洗验去浮选色后材再制的装片共显微性观察原则：
加三碘、液 实到验待的测共液性（操物作）过中程：
1、选用的实验材料含有相关物质且量高。 2生、物材组料织中中不成含分有的对检实测验实结验果产生影响的其他有色的物质。
感谢观看
质。 甲涂基片绿 、—水派解洛（宁盐酸（破吡坏罗膜红，）便染于液染液染色）、漂洗（洗去酸液）、染色、显微观察
材不料同切 物薄质片与后特染定色的，化洗学去试浮剂色的后特再定制显装色片反显应微。观察 不加同碘物 液质到与待特测定液的（化物学）试中剂的特定显色反应。
三、实验的共性操作过程： 不2、同材物料质中与不特含定有的对化实学验试结剂果的产特生定影显响色的反其应他。有色的物质。
生物组织中成分的检测实验
物质 检测用试剂
检测条件与过程颜色反应淀粉 碘液加碘液到待测液（物）中 蓝色
还原糖
斐林（本尼 迪特）试剂
加试剂后水浴加热
砖红色沉 淀
蛋白质 双缩脲试剂 先加A液再加B液
紫色溶液
脂肪 苏丹Ⅲ
材料切薄片后染色，洗去浮 色后再制装片显微观察
橙黄
细胞生物学实验-细胞化学
细胞化学是细胞形态学与化学、生物化学之间的边缘科学。
其特点是利用已知的化学反应，在保持细胞原有的形态结构上，以化学反应的方法显示出细胞中的化学成分，然后通过光学显微镜进行定性、定位和定量分析。
细胞化学不但有利于研究细胞的形态联系功能与代谢，定位显示化学性质和化学成分，而且还有利于确定细胞的特征及化学成分的变化规律、细胞损伤状态的诊断、病因机制和预后治疗等。
随着现代科学技术的发展，细胞化学除了普通染色及光学显微镜基础上的细胞化学外，电镜细胞化学、荧光细胞化学、免疫细胞化学等现代细胞化学技术正在广泛应用，这些技术不但丰富了细胞化学的研究内容，而且进一步加深了我们对细胞结构及活动规律的了解。
实验目的：1.了解并掌握Brachet反应的原理和操作方法2.了解并掌握细胞中多糖和过氧化物酶反应的原理和方法实验器材：DNA和RNA的Brachet染色普通光学显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、洋葱鳞茎表皮（1）Unna试剂：甲基绿派洛宁染色液甲液：5％派洛宁水溶液6 ml，2％甲基绿水溶液6 ml，蒸馏水16 ml 乙液：1 M乙酸缓冲液（pH 4.8）16 ml甲、乙两液分别置4℃冰箱备用，用时甲乙两液混匀。
（2）1 M乙酸缓冲液（pH 4.8）：A液：冰醋酸6 ml加蒸馏水至100 mlB液：乙酸钠13. 5g加蒸馏水至100 ml取A液40 ml＋B液60 ml混匀后pH为4.8。
实验器材：细胞中多糖和过氧化物酶反应普通光学显微镜、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、洋葱鳞茎、马铃薯块茎（1）高碘酸溶液：高碘酸（HIO4·2H2O）0.4 g，蒸馏水10 ml、95％乙醇35 ml，1/3 M乙酸钠溶液（2.72 g乙酸钠溶于100 ml H2O）5 ml，。
（2）Schiff试剂：称取0.5 g碱性品红加入到100 ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5 min（勿使之沸腾），使之充分溶解。
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一、目的要求
㈠掌握血涂片及骨髓涂片制作方法。 ㈡掌握碱性蛋白、过氧化物酶及核酸显示的原理。 ㈢熟悉上述化学成分在细胞中的分布。 ㈣了解上述化学成分显示的方法。
㈡实验方法
1. 临时装片的制备。 2. 固定：70%乙醇，10min。 3. 70℃～90℃ ，5%三氯醋酸， 15分。 4. 清水冲洗。 5. 染色：碱性固绿染色5min。 6. 清水冲洗。 7. 晾干，镜检。
1. 取材。 2. 2. 固定：0.5%硫酸铜，30s～1分钟。 3. 氧化： 联苯胺，3～6分钟。 4. 清水冲洗。 5. 染色： 1%番红，1～2min。 6. 清水冲洗。 7. 晾干镜检。
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6. 清水冲洗。 7. 风干，镜检。
5. 分化：纯丙酮。
6. 镜检。
➢ 过氧化氢酶的显示 ㈠实验原理
过氧化氢酶系能把许多胺类物质氧化为 有色化合物，若用联苯胺混合液处理标本， 细胞内的过氧化氢酶能把联苯胺氧化为蓝色 的联苯胺蓝，进而变为棕色的联苯胺腙。
㈡实验方法－家兔骨髓细胞中 过氧化氢酶的显示
➢ DNA和RNA的显示 ㈠实验原理 利用碱性染料甲基绿和派洛宁处理细 胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同 的颜色，这种颜色上的差异是由DNA和 RNA聚合程度的不同所引起。
㈡ 实验方法－蟾蜍血涂片DNA和RNA的显示 1. 制备蟾蜍血涂片：同上。 2. 固定：70%乙醇，5min，晾干。 3. 染色：甲基绿—派洛宁，10min。 4. 清水冲洗。 5. 分化：纯丙酮。 6. 镜检。
碱性蛋白
DNA和RNA
1. 临时装片的制备。
1. 制备蟾蜍血涂片：同上。
2.固定：70%乙醇，10min。 2. 固定：70%乙醇，5min，
3. 70℃～90℃ ，5%三氯醋酸， 晾干。
15分。
3. 染色：甲基绿—派洛宁，
4. 清水冲洗。
10min。
5. 染色：碱性固绿染色5min。 4. 清水冲洗。