循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展

・４５０・肿瘤２００８年５月第２８卷第５期ＴｕｍｏｒＶ０１．２８，Ｎｏ．５，Ｍａｙ，２００８

ＤＯＩ：１０．３７８１／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－７４３１．２００８．０５．０２１

循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展

Ｒｅｖｉｅｗ・综述

黄同海１，王正‘，李富荣２

（暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院１．胸外科；２．临床医学研究中心，深圳５１８０２０）

［摘要］研究发现，实体瘤患者外周血中存在循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞的检测有助于发现早期肿瘤患者的微转移，重新确定临床分期，监测患者术后肿瘤是否复发与转移，评估预后，选择个体化的治疗策略。由于存在循环肿瘤细胞检测方法、原发肿瘤细胞的不连续脱落、基因组的不稳定性及无效转移等诸多问题，循环肿瘤细胞检测的生物学意义和临床意义仍存在很大争议。本文综述了对实体瘤患者循环肿瘤细胞检测的方法和结果，并探讨当前肿瘤研究领域面临的问题和潜在的进展。【关键词］肿瘤循环细胞；肿瘤转移；诊断技术和方法

［中图分类号］Ｒ７３－３７；Ｒ７３０．４３［文献标志码］Ａ［文章编号］１０００－７４３１（２００８）０５－０４５０－０３

肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。深入研究循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）有助于对肿瘤转移机制的了解，为抗转移治疗提供依据。随着检测技术的小断改进，研究者们对ＣＴＣｓ的生物学特性的认识得到不断更新和完善。这可能为肿瘤患者的预后评估、抗肿瘤药物的开发和肿瘤的个体化治疗提供强有力的工具。

ＣＴＣｓ是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。由于宿主的免疫识别和机械杀伤作用以及肿瘤细胞自身因素，进入循环的肿瘤细胞很大一部分发生凋亡，不能形成转移灶，这种现象称之为“无效转移”¨ｏ。只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。因此，在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。

１ＣＴＣｓ的检测方法

１．１细胞计数法细胞计数法是最早应用于检测外周血ＣＴＣｓ的方法并且是当前鉴定骨髓中微转移的标准方法。细胞计数法的优点是，可在形态学上鉴别恶性表型并在单个细胞水平上进一步检测特定分子，但标准的光学显微镜和免疫细胞化学法存在敏感性低、检测繁琐、费时、易误诊等缺点。随着细胞自动成像和细胞富集方法等的产生，重新激起了研究者对应用细胞汁数法检测ＣＴＣｓ的兴趣。…。数字显微镜能自动扫描以核特征和细胞表面特征为摹础的血标本，而操作者只需确定分选的细胞即可。新近应用的上皮肿瘤细胞容量分离法（ｉｓｏｌａｔｉｏｎｂｙｓｉｚｅｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＩＳＥＴ），不仅能计数肿瘤细胞，而且能进行免疫形态学和分子特征的分析¨Ｊ。ＦＣＭ广泛应用于血液领域，不仅能鉴定特定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力，进一步扩大在体外的功能研究。

［基金项目］国家科技攻关计划项目（编号：２００３ＢＡ３１０Ａ２３）

［作者简介】黄同海（１９８２一），男（汉族），硕士，住院医师

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ（王正）

Ｅ—ｍａｉｌ：Ｗａｎｇｚｎ０５０３＠１６３．ｔｏｍ１．２ＰＣＲ方法ＰＣＲ方法是检测ＣＴＣｓ最普遍的一种方法。该方法通过设汁获得与目的基因特异性互补的寡核苷酸引物而具有较高的特异性。应用ＰＣＲ方法可在１０６一ｌＯ７个正常细胞中检测出１个肿瘤细胞，相当于１～１０ｍＬ血中可发现１个肿瘤细胞，与光学显微镜检测（１０２一１０３个正常细胞中发现１个肿瘤细胞）和免疫组织化学方法（１０４—１０５个正常细胞中发现１个肿瘤细胞）相比具有更高的敏感性“。然而，由于该方法的高度敏感性，极易产生假阳性的结果。这是冈为外周血白细胞的非法转录、静脉穿刺时血标本的污染及假基因的干扰等造成，但随着实时定量ＰＣＲ技术的出现，使精确定量靶序列成为可能。

以ＤＮＡ作为ＰＣＲ的模板，其优势是它的稳定性和肿瘤细胞异常转录的独立性。但是它的缺点是敏感性低，并且不能鉴别目的基因ＤＮＡ来源于活细胞还是死细胞。

以ｍＲＮＡ作为模板进行ＲＴ—ＰＣＲ也是ＣＴＣｓ检测最常用的一种方法。首先将ｍＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，随后用特异性的引物扩增获得日的基因。引物设计时可以跨越２个不同的外显子，为避免整个基因组的扩增，有利于消除假阳性结果。ＲＴ—ＰＣＲ的优点是可以检测原代活细胞，缺点是在某个特定肿瘤细胞内一个基因ｍＲＮＡ的拷贝数量在细胞周期中是不断变化的，并且存在去分化的现象，这可能影响标准ＰＣＲ的阳性率和实时定量ＰＣＲ检测的标志物水平，从而较难区别肿瘤细胞数量与ｍＲＮＡ表达水平之Ｉ’日Ｊ的变化。然而用多位点ＰＣＲ分别检测来自不同基因家族的ｍＲＮＡ标志物即可解决这个问题一－。

１．３细胞富集方法密度梯度离心法足目前实验室常用的一种收集肿瘤细胞的方法，但该方法缺乏特异性，因而易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。新近发展起来的免疫磁性细胞富集法则具有较高的特异性和富集效率。其基本原理即采用均匀、球形具有超顺磁性及保护壳的纳米微粒制备成免疫磁珠，使之成为既能被磁铁所吸引，又能结合抗体的载体。磁珠上的抗体与含有特异性抗原物质的细胞结合后，则形成细胞抗原．抗体一磁珠免疫复合物，在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性细胞的目的。目前商业化的磁珠包括阳性分选磁珠和阴性分选

万方数据

第５期．黄同海，等．循环肿瘤细胞检测及临床应用的研究进展・４５ｌ・

磁珠２种，国外已有报琦６｜，其富集效率与一般的分离方法相比可提高１０３一１０４倍。但该方法不能应用于缺乏细胞表面标志物的非上皮起源的实体瘤细胞（如肉瘤），且富集过程中可能存在ＣＴＣｓ丢失的缺陷。

２临床应用

２．１黑素瘤有关黑素瘤患者的ＣＴＣｓ和临床分期、临床结果相关已有诸多报道。ＭＪ，但由于转移瘤基因组不稳定性、ＣＴＣｓ不连续脱落进入血流和ＣＴＣｓ数量少等因素导致不同的研究结论，因此，多重肿瘤标志物和连续血标本的检测可能提高ＣＴＣｓ检测的可靠性。理论上，在病程中可以检测出ＣＴＣｓ的最低可能性在肿瘤发生的Ｉ期，而Ⅳ期时，由于恶性肿瘤基因组的不稳定性可能导致ＣＴＣｓ检测时肿瘤标志物的表达的异常。因此，一些研究者集中研究肿瘤中期（Ⅱ期和Ⅲ期）时ＣＴＣｓ阳性结果的预后价值。９Ｊ，另一方面这些发现有助于用来证明某些辅助治疗对预后的影响。

２．２乳腺癌由于应用抗上皮细胞抗体的免疫磁性细胞富集检测方法的出现，采用细胞计数法研究外周血中乳腺癌ＣＴＣｓ的方法引起广泛关注。这些研究证明，在每毫升外周血中存在数千个ＣＴＣｓ，而事实上，在转移性肿瘤患者的每毫升血中如有少量的ＣＴＣｓ就能估计不良的临床预后¨…。来自大多数乳腺癌的前瞻性研究表明，ＣＴＣｓ阳性与临床结果相关…Ｊ，在转移性肿瘤患者中，其清除率与标准的化疗和分子靶向治疗的效果密切相关，因此ＣＴＣｓ的检测可提示肿瘤对特定治疗方案的敏感性。１“。

２．３前列腺癌尽管细胞计数法已应用于前列腺癌，但大多数研究者仍经常采用ＰＣＲ方法对前列腺癌进行研究。虽然仍有一部分人质疑，但许多研究已证明ＣＴＣｓ的预后价值，尤其对尚无转移依据患者ＣＴＣｓ的检测更具意义。术前和术后ＣＴＣｓ的检测与分期和生存率相关，术后的检测证明在多变量分析中有预后意义¨３１。血浆中前列腺特异性抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ，ＰＳＡ）水平的检测是目前最常用的一种前列腺癌标志物，一些研究者将它的预后意义与ＣＴＣｓ相对比，但结果并不一致。

２．４结肠癌结肠癌患者ＣＴＣｓ检测的结论最具有争议性，众多报道显示运用单变量分析方法所得的结论不一致¨４。“，仅Ｋｏｃｈ等【ｌ６。报道用多变量分析方法所得的结论证明ＣＴＣｓ的检测可独立预测患者的生存期。其原因可能是因为肝作为了原发性结肠癌细胞脱落并释放进入门脉系统的过滤器。Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等ｕ叫报道证实，ＣＴＣｓ存在于门脉血中（不是外周血）支持这一假设，同时通过直肠癌肝转移患者的多变量分析的阳性结果显示，这些ＣＴＣｓ能够被递送进入体循环，避免肝过滤。

３问题与展望

３．１技术问题污染因素和引物设计不合理所导致的假基因获得使ＰＣＲ假阳性率高，而低质量的样品同样可降低ＣＴＣｓ的检出率。细胞计数法可快速获得结果（尤其是上皮性肿瘤），然而，应用该方法所获得的资料是有限的并且重复性和敏感性均不及ＰＣＲ方法。ＣＴＣｓ检测最关键的问题是需要有最婵想的检测数量，由于缺乏大规模的对照研究，至今仍未提出有效合理的指南，这使ＣＴＣｓ研究的设计成为个人实验和研究者的主张，很难对比不同的结论。

３．２生物学因素解决生物学问题似乎比技术问题更具挑战性。ＣＴＣｓ的间断脱落进入血流和肿瘤细胞的基因组不稳定性都可导致假阴性结果。“无效转移”现象使ＣＴＣｓ检测的预后意义变得模糊。最近，与肿瘤细胞生存或凋亡和转移潜能有关的分子靶向技术已运用于ＣＴＣｓ的检测，有可能会提供更多的预后信息。最新生物技术进展能够检测不仅来自细胞极少的标本而且来自单个细胞整个基因或蛋白序列，这可能特别适宜对不同转移潜能的ＣＴＣｓ进行研究。Ｓｍｉｒｎｏｖ等’“Ｊ已开发出高通量基因筛选技术，证明未知功能基因表达的分子是区分ＣＴＣｓ与外周血白细胞的主要特征，强调当前运用于ＣＴＣｓ检测的标志物可能不是最适宜鉴别这些细胞。Ｌａｎｇｅｒ等。１引用单个细胞比较基因组杂交技术证明ＣＴＣｓ的基因组不稳定性。强调ＣＴＣｓ亚型的重要性，以便提供有用的预后价值。而且，在基因水平上对单个ＣＴＣｓ特征进行分析被认为是一种最具前途的靶向抗肿瘤治疗的方法－驯。

经研究证实，实体瘤患者的外周血中存在肿瘤细胞，ＣＴＣｓ的存在是肿瘤转移必需的，因此研究者可把ＣＴＣｓ作为未来正式的一种预后标志物。另外，它也是实体瘤的“先锋”，被认为是一种有效的抗肿瘤药物的新靶标。然而，在ＣＴＣｓ检测成为肿瘤患者一种临床常规检查手段之前，尚有些问题尚需要解决：（１）如何进行合理的实验设计和应用最新的技术来提高实体瘤患者外周血中ＣＴＣｓ的检出率；（２）如何应用最新的技术进行大规模临床试验研究以证明其检测对预后的意义；（３）ＣＴＣｓ是分散在无数外周』ｆ『Ｌ单核细胞中数量极少的细胞，如何应用最新的生物技术来全面阐述其分子特征；（４）如何应用生物学鉴定方法来确定那些具有高度转移潜能的ＣＴＣｓ分子序列，以确定一种理想的标志物来检测ＣＴＣｓ，以便设计获得更有效的抗肿瘤药物。最新的生物技术进展可帮助研究者提高检测的精确性和认识其生物学行为，这或许可鉴另４具有转移潜能的ＣＴＣｓ亚型和提供最好的预后意义。

ＣＴＣｓ的生物学意义和预后意义只有在大规模、前瞻性和相似患者人群组中进行检测才能有意义。未来进展可能需要在严格控制临床试验的基础上去评价基于ＣＴＣｓ的治疗方案对患者生存的影响。

［参考文献］

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ｔｉｅｎｔｓｕｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎｄｄｉｇｉｔａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ

［Ｊ】．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００２，８（５）：１０８５—１０９１．

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