犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化
犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化_陈胜男
新疆农业大学学报2011,34(1):59~61Journal of Xinj iang Agricultural U niversity文章编号:1007-8614(2011)01-0059-03犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化陈胜男,马素贞,翟少伦,简子健(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐830052)摘要:为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21(D E3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-P AG E电泳分析证明V P2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathio ne Sepha rose4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。
结果表明,重组质粒E.coli BL21(DE3)在35e,1.0mmol/mL IP T G诱导6h时条件下蛋白表达量最高。
SDS-P AG E电泳检测的纯化目的蛋白约为90kDa,与预计大小一致。
VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。
关键词:犬细小病毒;V P2基因;融合蛋白;优化与纯化中图分类号:S851.659.2文献标识码:AOptimization and Purification of Prokaryotic Expression ofCanine parvovirus VP2GeneCH EN Sheng-nan,M A Su-zhen,ZH AI Shao-lun,JIAN Z-i jian(Colleg e of Anim al M edicine,Xinjiang Ag ricultur al University,U rumqi830052,China) Abstract:In or der to impr ove the expressio n level of Canine p arv ovir us(CPV)VP2gene in Escher ichia coli,optimal conditions for expression level of GST-VP2fusio n protein w er e analy zed by SDS-PAGE at dif-ferent concentratio n,temperature and tim e of employed inducer(IPTG).T he protein w as purified by gluta-thione sephar ose4B affinity column.T he results sho wed that the fusion pr otein ex pr ession of r ecombinant plasmid Escher ichia coli,BL21(DE3)w as the optimal w hen1.0mmo l/mL IPT G w ere induced for6h at 35e.Fusion protein purified by Glutathio ne Sepharo se4B affinity column w as about90kDa w hich w ere consistent w ith the ex pected size by SDS-PAGE.T he optim ized expressio n and purificatio n of VP2gene fu-sion protein set the base for study ing sub-unit v accine of CPV.Key words:Canine p ar vov ir us;VP2;fusion protein;optimization and purification犬细小病毒(Canine p avovir us,CPV)属于细小病毒科,细小病毒亚科,细小病毒属[1],于1978年首次发现[2,3]。
犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达
也 被 叫做 Ｃ Ｖ一 １ 而 将 后 来 发 现 的 病 毒 命 名 为 Ｐ ）
Ｃ Ｖ一 ２ 因 此 ， Ｐ 只 有 一 个 抗 原 型 ， Ｃ Ｖ 一 ２ Ｐ ， Ｃ Ｖ 即 Ｐ 。
高 ， 染 性强 ， 传 死亡 率 高 ， 病 是 我 国养 犬 业 较 严 重 该
的传 染病 ， 泛 的 传 播 蔓 延 ， 成 了严 重 的经 济 损 广 造
ｔ ｉ Ｏ ｓ ｒ ｅ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｓｓｏ Ｖ ，ｔ ｅｆ ａ ｍ ｅ ｔｏ Ｖ 一 ２ ｅ ｎ ｔ ｅ ｖ ｈ ｉｇ ｏ ｉ ｆＣＰ ｈ ｒ ｇ ｎ ｆＣＰ ｂＶＰ２ ｇ ｎ ｓ ｃｏ ｅ ｒ ｍ ｌ ｎ ｄ ｖ ｃｏ ｙ Ｐ ｅ ｅ ｗａ ｌｎ ｄ ｆ ｏ ｃｏ ｅ ｅ ｔ ｒ ｂ ＣＲ．Ｔｈ ｎ ｅ，
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ ２ Ｉ３ ．
Ｍ ａ １２ ｙ ２０
犬 细 小 病 毒 Ｖ ２主 要 抗 原 表 位 区 的 Ｐ 原 核 表 达 载 体 构 建及 诱 导 表达
马 辉 ，赵 绪 永
（ 州牧 业工程 高等 专科 学校 生物 工程 系，河 南 郑 州 ４ ０ １ ） 郑 ５ ０ １
ｒｃ ｅ ｏｍ ｂ ｎ ｎｔＥ．ｃ ｌ ｓ ｒ ｉ ＢＬ一 ２１ ｗ ａ ｎｄ ｅ Ｏ ｅ ｐｒ ｓ ｈｅｆ ｉ ｏｔ ｉ ｖ Ｉ ｉａ ｏ ｔ ａｎ ｓ ｉ ｕｃ ｄ ｔ ｘ ｅ ｓ ｔ ｕｓｏｎ ｐｒ ｅｎ ｂ ＰＴＧ ． Ｔ ｈ ｘｐ ｅ ｓ ｄ ｐ ｏｄ ｔｏ ｒ ｅ ｅ ｒ ｓ ｅ ｒ ｕｃ ｉｎｓ ｗｅ ｅ
犬 细 小 病毒 病 是 由犬 细小 病 毒 （ ａ ｉｅｐ ｒｏ Ｃ ｎｎ ａｖ —
微小 病毒 （ ｎ ｔ ｉ ｓｏ ａ ｉｅ Ｍｉｕｅｖｒ ｆｃｎｎ ，ＭＶＣ） 习惯 上 ｕ （
犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定
Ｂ ｕ ｇ Ｂ ｕ ｓ ｔ ｅ ｒ 购 自美 国 Ｎｏ ｖ ａ ｇ ｅ ｎ公 司 ； Ａｎ ｔ ｉ — Ｈｉ ｓ单 抗 和 ＨＲ Ｐ － Ｇｏ ａ ｔ ａ ｍｔ ｉ — Ｍｏ ｕ ｓ ｅ酶 标 二 抗 购 自武 汉 三 鹰
生物 技术 有 限公 司 ； 犬 五联多抗 购 自西诺 洁 普公 司 ；
减少 及 心肌炎 为 主要特 征ｎ ］ ， 该 病 发 病率 高 ， 传 染性 强， 病 死 率高 ， 成 为 危害犬 和猫 健康 的重要 传 染 病之
一
＿ ｌ ２ ］
。
该病 的病 原是犬 细 小病毒 （ Ｃ ａ ｎ ｉ ｎ ｅ ｐ ａ ｒ ｖ ｏ ｖ ｉ ｒ —
１ 材 料 与 方 法
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ５ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ６ — ０ ０ ２ ４ — ０ ６
犬细小 病毒 病 以 出血 性肠 炎 、 剧 烈呕 吐 、 白细胞
株高 效表 达菌 株 ， 表 达 的 重组 蛋 白具 有 良好 的反 应 原性 ， 为进 一 步研 究 相 应 的 抗 体检 测 试 剂 盒 和基 因 工程 亚单 位疫 苗奠定 了基 础 。
１ ． １ 材料
Ｕ Ｓ ， Ｃ Ｐ Ｖ） ， 该病 毒属于细小病毒科 （ Ｐ ａ ｖ ｏ ｖ ｉ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ） ， 细小 病毒 属 （ Ｐａ ｖ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） 。该 病毒 基 因组 为单 股 、 负 链、 线形 Ｄ ＮＡ， 全长 ５ ３ ２ ３ ｂ ｐ ， 编 码 ３个 结 构 蛋 白 ＶＰ １ 、 ＶＰ ２和 ＶＰ ３ ， 其中， ＶＰ ２基 因全长 １ ７ ５ ５ ｂ ｐ ， 编
载体 ｐ Ｅ Ｔ２ ８ ａ为 Ｎｏ ｖ ａ ｇ ｅ ｎ公 司 产 品 ； 大 肠 埃 希 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 感 受 态 细 胞 购 于 北 京 天 根 生 化 科 技
犬细小病毒VP2基因
分类号：单位代码：10019 密级：学号：S0*******硕士学位论文北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析和流行病学调查Sequence analysis of VP2 gene and epidemiological survey ofcanine parvovirus in Beijing研究生：宋永奇指导教师：吕艳丽副教授合作指导教师：申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学所在学院：动物医学院2008年 5 月独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月摘 要犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染是目前危害养犬业的最严重传染病之一。
为了了解CPV的变异情况，本研究在2006-2007年间不同时间采集CPV感染患犬粪便样本20份，经PCR方法从中扩增出了CPV VP2基因，并对该基因进行了序列测定与分析；为了了解本病的流行状况，本研究对临床上常用的CPV检测方法的可靠性进行了评估，并在此基础上对2005-2007年到中国农业大学动物医院诊治的所有有呕吐、腹泻和呕吐或腹泻症状的犬粪便样本的CPV检测结果进行了统计分析，获得如下结果：VP2基因全长1755bp，编码585个氨基酸。
犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化
表 达 载 体 ｐＥＴ—ＶＰ２，转 化 至 大 肠 杆 菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）感 受 态 细胞 中 ，在 不 同 ＩＰＴＧ浓 度 、诱 导 温 度 和 诱 导 时 间 条 件 下 进
行 原 核 表 达 ，确 定 最 佳 诱 导条 件 。最 佳 条 件 下 的 诱 导 产 物 经 超 声 破 碎 离 心 后 ，利 用 镍 柱 对 重 组 蛋 白进 行 纯 化 ５
文 献 标 识码 ：Ａ
文 章编 号 ：１６７１－７２３６（２０１８）０３—０６４３—０７
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＰ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ
ＬＯＮＧ Ｄａｎｄａｎ ， ＪＩ Ｘｉｎｑｉｎ ， ＤＵＡＮ Ｚｈｉｑｉａｎｇ 。， ＲＵ ＡＮ Ｙｏｎｇ 。， ＣＨＥＮ Ｑｉａｎｇ ， ＬＥＩ Ｙｕｎ 一， Ｗ ＡＮ Ｂｉａｏ ， Ｈ Ｕ Ｙａｎ
形 式 存 在 ；纯 化 后 获 得 的 重 组 蛋 白 ，经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ双 重 鉴 定 ，均 在 ６４ ｋｕ处 出现 条 带 ，说 明纯 化
后 的 蛋 白为 重 组 蛋 白 ｐＥＴ—ＶＰ２。本 试 验 通 过 对 ＣＰＶ ＶＰ２蛋 白 的 原 核 表 达 及 纯 化 成 功 获 得 了 大 量 纯 度 较 高 的
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ进 行 双 重 鉴 定 。 结 果 显 示 ，重 组 质 粒 ｐＥＴ—ＶＰ２经 双 酶 切 鉴 定 分 别 获 得 大 小 为
５ ９００ ｂｐ左 右 的载 体 条 带 和 １ ７５５ ｂｐ左 右 的 目的 基 因 条 带 ，成 功 构 建 了 ｐＥＴ—ＶＰ２重 组 质 粒 ；重 组 ＶＰ２蛋 白 的分 子
一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用[发明专利]
![一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/adfd748ef5335a8103d220bf.png)
专利名称：一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用
专利类型：发明专利
发明人：吴晓杰,金继祖,吴银飞
申请号：CN202010646022.0
申请日：20200707
公开号：CN111875677A
公开日：
20201103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用，包括一种犬细小VP2蛋白重组抗原基因、由该基因编码的一种犬细小VP2蛋白重组抗原、一种表达犬细小VP2蛋白重组抗原的方法及其在制备胶体金中应用。
本发明在大肠杆菌表达系统中重组表达了VP2蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点；重组蛋白上的His标签有利于一步纯化达到较高的纯度，并且不需酶切即可表现较好地活性；以重组抗原可作为犬细小病毒胶体金检测试剂条的一部分，敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为常规检测手段。
申请人：杭州傲锐生物医药科技有限公司
地址：311100 浙江省杭州市余杭区文一西路1500号1号楼209室
国籍：CN
代理机构：杭州杭诚专利事务所有限公司
代理人：尉伟敏
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犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化
犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化张坤;马丽娟;李刚;黄伟;李伟;贾凤琴【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2009(011)012【摘要】参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,对CPV VP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,获得重组质粒pGM-T-VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a-VP2,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E.coli Rosetta(DE3)中,获得了基因工程菌株E.coilRosetta(CVP2),并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化.结果表明纯化样品中含有87 kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带.E.coil Rosetta(CVP2)以包涵体形式表达出了CPV-YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础.【总页数】6页(P46-51)【作者】张坤;马丽娟;李刚;黄伟;李伟;贾凤琴【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;西南大学动物科技学院,重庆,北碚,400715;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094;西南大学动物科技学院,重庆,北碚,400715;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094【正文语种】中文【相关文献】1.犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析 [J], 颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华2.犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化 [J], 陈胜男;马素贞;翟少伦;简子健3.犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析 [J], 唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清4.犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析 [J], 卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平5.犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立 [J], 李慕瑶;姜骞;刘家森;司昌德;韩凌霞;曲连东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析
犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【摘要】试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础.从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体.序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80％,CPV-2b型占20％.本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低.Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性.该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】9页(P870-878)【关键词】犬细小病毒;VP2;基因型;原核表达【作者】卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;廊坊市动物疾病预防控制中心,廊坊065000;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q785犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性传染病[1]，临床上以急性出血性肠炎、呕吐为主要特征[2]。
犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化
犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化龙丹丹;嵇辛勤;段志强;阮涌;陈强;雷云;万彪;胡焱【摘要】为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化.采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET 32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件.最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定.结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2.本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)003【总页数】7页(P643-649)【关键词】犬细小病毒(CPV);VP2基因;原核表达;纯化【作者】龙丹丹;嵇辛勤;段志强;阮涌;陈强;雷云;万彪;胡焱【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵阳550025;贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州大学动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起的一种高度接触性、烈性传染病[1]。
犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测
犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测段欣强;张洪亮;周保琨;杨瑞梅;单虎【摘要】本研究旨在克隆犬细小病毒VP2 (CPV-VP2)基因,构建乳酸菌重组表达载体,以乳酸菌表达CPV-VP2目的蛋白,通过重组目的蛋白检测及分析,为CPV乳酸菌口服疫苗研究提供支撑.以PCR方法扩增CPV-VP2编码目的基因,纯化后连接表达载体pMG36e,构建重组乳酸菌表达载体pMG36e-VP2,电转至乳酸球菌MG1363感受态,经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析,挑选阳性重组菌株,命名为:pMG36e-VP2-MG1363.使用诱导剂Nisin诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting鉴定重组蛋白.结果显示,成功构建重组表达载体pMG36e-VP2,SDS-PAGE,结果表明,重组目的蛋白分子大小约65 kD,与理论值相符;Western Blotting结果表明,重组目的蛋白可被犬源CPV阳性血清所识别,具有良好免疫反应性.本研究用乳酸菌成功表达犬细小病毒蛋白,为该病新型疫苗的研究提供基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2018(054)010【总页数】5页(P7-10,15)【关键词】犬细小病毒;VP2;活乳酸菌载体;原核表达【作者】段欣强;张洪亮;周保琨;杨瑞梅;单虎【作者单位】青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;山东省即墨区畜牧兽医局,山东青岛266200;青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】S852.69犬细小病毒病(CPD),是由犬细小病毒(CPV)感染犬的一种致死性、急性、高传染性疾病。
CPV是细小病毒科,细小病毒属成员,该属成员有水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)等,相似性达到90%[1]。
犬细小病毒VP2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立_易立
彬, 张海玲, 吴
威 , 闫喜军
( 中国 农业科 学院 特 产研究 所 , 吉 林
Expression of VP2 gene of canine parvovirus virus and development of a recombi nant protein based indirect ELISA for antibodies detection
1. 7 间接 ELISA 最佳反应条件的选择 1. 7. 1 抗原最佳包被量和血清稀释度的选择 按 文献 [ 5] 方法进行间接 EL ISA 方阵滴定。选取某一 P / N( 阳性血清 D 值 / 阴性血清 D 值 ) > 2. 0, 且 P 在 1. 0 左右的抗原和血清稀释倍数, 确 7 . 2 其他影响 EL ISA 反应条件的选择 分别对 封闭液、 稀释液、 封闭时间, 血清反应时间、 酶标抗体 工作浓度、 酶标抗体作用时间、 底物作用时间这些反 应条件进行优化。 1. 8 判定标准的确定 用已初步确 定的条件, 对 30 份临床阴性血清进行 D 490 值的测定 , 检验结果采 用 Ex cel 软件进行分析, 确定 Cut of f 值。 1. 9 1. 9. 1 iVP2 ELISA 特异性试验 交叉试验 用已建立的 iV P2 ELISA 方法
Abstract: We develo ped an indirect ELISA method for detecting canine parv ov irus v irus ( CP V ) antibo dies based on the recombinant pertactin protein ex pr essed in Escher ichia col i ( D E3) stra in. Base on analysis of CPV V P 2 gene, w e desig n a pair of primers to am plify the g ene frag ment except 5' and 3' r are co do ns in bacteria system, and co nstuct pr okary otic ex pression vector pET 28a VP 2 and pET 32a V P2. T he recombinant plasmids w ere t ransfo rmed into E. coli BL21, and expressd after induced w ith IPT G. T he ex pressed pr oducts wer e purif ied by H is T ag of pET s v ecto r, and identified by SDS PA GE assay and W ester n blot. T he reco mbinant pro tein frag ment pET 28a VP 2 show ed a gr eat act ivit y o f immunity . T he pET 28a V P2 based indir ect EL ISA w as developed for detect ing antibodies ag ainst CP V named iVP 2 EL ISA. T he result show ed that the opimal co ncentration o f coated antigen w as 17. 8 mg/ L and the best dilution of of serum w as 1 20. T he positive crit er io n of this EL ISA assay w as D the tested serum > 0. 367 and D the tested ser um/ D the neg tiv e serum > 2. 0. T he method result was co nsistent with H A/ H I assay and iV P2 EL ISA , but not sugg est a direct pro po rtio n r elatio n. T he assay show ed excellent specificit y, sensitiv ity and r eduplica tion, and can be useful for epidemio lo gical sur vey and clinical diag nosis of canine par vo riv us. Key words: canine par vo vir us; pr okar yotic ex pression; VP 2 pro tein; indirect EL ISA assay * Cor r esp onding author , E mail : tcscs p @ 126. com
犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析
犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2006(035)001【摘要】从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamHI和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.【总页数】3页(P60-62)【作者】颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华【作者单位】福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;厦门大学抗癌研究中心,福建,厦门,361005;福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;厦门出入境检验检疫局,福建,厦门,361012;福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;福建农林大学动物科学学院,福建,福州,350002;厦门大学抗癌研究中心,福建,厦门,361005【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5【相关文献】1.犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建 [J], 王玉玲;范京惠;边亚娟;张炳丽;唐丽杰;李一经2.犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达 [J], 马辉;赵绪永3.犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达 [J], 简子健;马素贞;陈胜男;翟少华;赵森4.犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测 [J], 段欣强;张洪亮;周保琨;杨瑞梅;单虎5.三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 陈延宗;钱晶;王晶宇;赵航;毕振威;夏兴霞;诸玉梅;芮荣;王永山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立
犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立李慕瑶;姜骞;刘家森;司昌德;韩凌霞;曲连东【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2007(37)3【摘要】根据GenBank上发表的犬细小病毒(CPV)VP2蛋白基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增VP2基因全长。
将其克隆到pET-30a载体中,构建了原核表达载体pET-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白,Western-blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。
利用重组蛋白为抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15.8 ng/孔,血清的最佳稀释倍数为1∶100,建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。
【总页数】5页(P218-222)【关键词】VP2基因;原核表达;纯化;间接ELISA【作者】李慕瑶;姜骞;刘家森;司昌德;韩凌霞;曲连东【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2【相关文献】1.猪细小病毒VP2的原核表达及间接ELISA方法的建立 [J], 臧科伟;张春玲;邹勇;柴家前;崔言顺2.猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立 [J],王金良;沈志强;唐娜;曲光刚;魏凤;任艳玲;肖跃强;管宇3.猪细小病毒3型VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立[J], 王广操;崔鹏超;何玉;张梦岩;苑文涛;王先炜4.水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立 [J], 陈涛;赵建军;张海玲;柴秀丽;闫喜军;吴威;钱爱东5.大鼠细小病毒VP2原核表达及间接ELISA方法建立 [J], 霍娜;姚威;于婉琪;魏晓锋;萧飒;陈鸿军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析
犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清【摘要】根据犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV） SH14株基因序列设计引物，采用PCR方法扩增CPV VP2基因，经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后，将其克隆至pGEX-4T-1载体，构建重组表达载体pGEX-4T-VP2，经酶切鉴定和测序验证正确后转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达，应用SDS-PAGE法检测蛋白的表达。
然后，使用纯化的重组VP2蛋白制备其兔源多克隆抗体，分别应用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光检测该抗体的免疫原性。
结果表明，pGEX-4T-VP2能在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达，所制备的兔抗CPV-VP2抗体能与重组蛋白和病毒蛋白发生特异性反应。
本研究为研发CPV亚单位疫苗、检测技术及致病机理研究等奠定了物质基础。
%According to the genome sequence of CPV SH14 strain, a pair of specific primers were designed for amplifying VP2 gene in PCR. The resulting PCR product was digested with BamHΙand XhoΙand cloned into pGEX-4T-1 vector to obtain the recombinant plasmid pGEX-4T-VP2. Then, pGEX-4T-VP2 was transformed into E.coli BL21 cells with IPTG induction. The expressed products were identified in SDS-PAGE. Polyclonal antibodies against CPV VP2 were prepared with the purified recombinant VP2 by vaccinating rabbits. The rabbit antibodies were used in Western blot and indirect immunofluorescence to detect their reactivity with the expressed VP2. The results showed that the recombinant VP2 expressed in E.coli BL21 cells reacted positively with rabbit polyclonal antibodies. The availability of the recombinant VP2 has laid the solidfoundation for development of subunit vaccine, diagnostic methods and pathogenic mechanism research for CPV.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2016(024)001【总页数】6页(P38-43)【关键词】犬细小病毒;VP2基因;原核表达;免疫原性【作者】唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241; 安徽农业大学动物科技学院，合肥230036;中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241; 安徽农业大学动物科技学院，合肥230036;中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241; 甘肃农业大学，兰州730070;中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241; 甘肃农业大学，兰州730070;中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241;安徽农业大学动物科技学院，合肥230036;中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）属于细小病毒科，细小病毒属，该病毒属还包括猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）、水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus，MEV）、猪细小病毒（Poecine parvovirus，PPV）、鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）等，它们之间的相似性高达90%[1]。
犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性_王微[1].
![犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性_王微[1].](https://img.taocdn.com/s3/m/4a3c27b6e009581b6bd9ebdd.png)
Re search Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(5 :648-652; 4May 2009ISS N 0001-6209; C N 11-1995ΠQ http :ΠΠjournals. im. ac. cn Πactamicrocn基金项目:国家自然科学基金(30771586 ; 河北省自然科学基金(C2008000244 ; 河北省人事厅留学人员科技活动择优资助项目(200808083通信作者。
T el :+86231227528473; E 2mail :feizhong2000@yahoo. com作者简介:王微(1983- , 女, 河北省秦皇岛人, 硕士研究生, 主要从事基因工程药物方面的研究。
E 2mail :airenwu@1261com 收稿日期:2008211219; 修回日期:2009202225Δ引用自该课件犬细小病毒VP2王微1, 李秀锦2, 131, 111, 李巍1(1 (2, 秦皇岛066004摘要:【目的】利用真核细胞分泌表达犬细小病毒VP2蛋白和研究其特性。
【方法】为构建犬细小病毒(Canine parv ovirus , CPV VP2基因的真核分泌型表达载体, 首先通过酶切从含有人C D5信号肽序列的质粒中将C D5信号肽基因片段切出, 将其连接到真核表达载体pcDNA311A 的多克隆位点上, 构建成pcDNA3112C D5sp质粒。
然后再通过PCR 方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2基因, 并将其插入到pcDNA3112C D5sp 载体中C D5信号肽的下游, 构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA 2C D5sp 2VP2。
经磷酸钙介导转染293T 细胞, 使其在真核细胞中进行分泌表达, 并通过E LIS A 检测表达的VP2蛋白与犬转铁蛋白受体(T fR 结合的活性。
犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达
犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导
表达
马辉;赵绪永
【期刊名称】《郑州牧业工程高等专科学校学报》
【年(卷),期】2012(032)002
【摘要】利用PCR扩增CPV-2bVP2蛋白的主要抗原表位区基因，并将该基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上，通过诱导表达条件的摸索，实现了VP2
蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达，sDs—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在，并利用亲和层析得到融合蛋白。
【总页数】3页(P9-11)
【作者】马辉;赵绪永
【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校生物工程系,河南郑州450011;郑州牧业
工程高等专科学校生物工程系,河南郑州450011
【正文语种】中文
【中图分类】S852.655
【相关文献】
1.虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达和蛋白纯化 [J], 田丽红;华育平
2.水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达 [J], 梁冬莹;华育平;曾祥
伟
3.猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达 [J], 周洁;陈义平;楚电峰;朱吕昌;罗飞;张秀娟
4.犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究 [J], 吴植;曹斌;贺生中;戴建华;吴迪
5.猪细小病毒3型VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立[J], 王广操;崔鹏超;何玉;张梦岩;苑文涛;王先炜
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犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达
犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达李希阳;缪勤;张爱华;张洪英;张汇东;张海彬【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2008(40)12【摘要】以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。
将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。
双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。
转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。
免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。
【总页数】4页(P15-18)【关键词】犬细小病毒南京株;VP2基因片段;克隆;表达【作者】李希阳;缪勤;张爱华;张洪英;张汇东;张海彬【作者单位】南京农业大学动物医学院,江苏南京210095;公安部南京警犬研究所,江苏南京210012;南京市疾病预防控制中心,江苏南京210003【正文语种】中文【中图分类】S858.292【相关文献】1.犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定 [J], 毛倩倩;卜宾;唐青海;阚云超;姚伦广;唐存多;焦铸锦;杨建伟2.犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析 [J], 唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清3.犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 毛倩倩;崔尚金;周灵;唐青海;卜宾;唐存多;焦铸锦;姚伦广;阚云超;杨建伟4.犬细小病毒南京株(CPV-GN)衣壳蛋白vp2基因的克隆与序列分析 [J], 李希阳;缪勤;张汇东;张洪英;张海彬5.表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定 [J], 谢之景;夏咸柱;扈荣良;杨松涛;邹啸环;黄耕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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１ ０ ｍ ｌｍＬ Ｉ Ｔ 诱 导 ６ ｈ时 条件 下 蛋 白 表 达 量 最 高 。Ｓ Ｓ Ｐ ＧＥ电 泳 检 测 的 纯 化 目的 蛋 白约 为 ９ Ｄ ， 预 ． ｍｏ／ Ｇ Ｐ Ｄ －Ａ ０ｋ ａ与 计 大小 一致 。ＶＰ ２基 因融 合 蛋 白 的优 化 表 达 和 纯 化 为 研 究 犬 细 小 病 毒 亚 单 位 疫 苗 奠 定 了基 础 。 关 键 词 ： 犬 细 小 病 毒 ； ２基 因 ； 合蛋 白 ； 化 与 纯 化 ＶＰ 融 优
犬 细 小病 毒 ＶＰ ２基 因 原核 表 达 条 件优 化 与 蛋 白纯化
陈 胜 男 ， 素 贞 ，翟 少 伦 ， 子 健 马 简
（ 疆 农 业 大 学 动 物 医学 学 院 ， 鲁 木 齐 新 乌 ８０ ５ ） ３ ０ ２
摘
要 ： 为 了 提 高 犬 细 小 病 毒 ＶＰ ２基 因 在 大 肠 杆 菌 Ｅ．ｃ ｌ ＢＬ １（ ｏｉ ２ ＤＥ３ 中 的表 达 量 ， 过 改 变 诱 导温 度 、 导 时 ） 通 诱
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间 及诱 导剂 浓 度 等 条 件 对 表 达 量 产 生 影 响 ， Ｓ ＳＰ Ｅ 电 泳 分 析 证 明 ＶＰ 以 Ｄ － ＡＧ ２基 因 蛋 白表 达 的 最 佳 条 件 ， 通 过 并
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新 疆 农 业 大 学 学 报
２ １ ， ４ １ ： ９ ６ ０ １３ （ ）５～ １
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文章 编 号 ：１ ０ — ６ ４ ２ １ ） ｌ０ ５ — ３ ０ ７８ １ （ ０ １ Ｏ 一 ０ ９０
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