第五章基因的分离与鉴定1要点

用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体
冰浴放置12 - 24小时，备用
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化
取100 μl 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重 组DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1- 2分钟 加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
重组DNA分子的构建
构建重组DNA分子的途径
重组子分子导入受体细胞的途径
转化(transformation) 转染(transfection)
转导（transduction）
转化（transformation）：
将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受 体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
基因的分离与鉴定




DNA克隆片段的产生和分离 重组体DNA分子的构建及导入受 体细胞 基因克隆的实验方案 克隆基因的分离 重组子的选择与鉴定
克隆的概念
克隆, 是英文Clone 的音译, 它是
由一个个体经无性繁殖所产生后代的总称，
也可以是指用其它方式产生无性繁殖后代
的技术。有两个缺一不可的特征：既是无
E.coli的电穿孔转化
在高压电场下使细胞产生瞬间的穿 孔，这个穿孔足够大并可维持足够的 时间，使外源DNA进入受体细胞。电 穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3 个数量级。这种方法也可用于真核生 物的转染
电穿孔转化
将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转 化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场 的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或 DNA重组分子便可进入细胞内
体外包装颗粒的转导 将重组的 λ噬菌体DNA或重组的 柯斯载体DNA经体外包装成具有感染 能体力的λ噬菌体颗粒，然后经由在 受体细胞表面上的λDNA接受位点， 使这些带有目的基因序列的重组体 DNA注入大肠杆菌。
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等） 接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类 细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态） 转化的方法转移质粒或重组DNA分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进 行转化
细菌原生质体的制备
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链 霉菌为例： 细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖 溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌 酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮 在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触 的所有器皿应保持无水无去污剂
细菌原生质体的转化：
取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质 体），加入10 - 20 μl DNA重组连接液，同时加 入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀
细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞 壁。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和 微量元素
Fra Baidu bibliotek
性生殖，又是遗传同质（相同的遗传物
质）。
一、目的基因的分离
1.从生物基因组分离目的基因 利用基因文库筛选目的基因 基因组文库 、cDNA文库 利用mRNA或cDNA钓取目的基因
2. 利用基因表达产物来获取目的基因 使用探针从cDNA文库中筛选目的基因 3.用酶学或化学方法合成目的基因 逆转录酶法合成目的基因 PCR法合成目的基因 化学合成目的基因 胰岛素基因、干扰素基因等市场化
二、目的基因的来源
1. 基因组DNA的非特异性断裂 2. 染色体DNA的限制性内切酶酶解 3. 通过mRNA合成cDNA 4. 人工体外合成DNA片段 5. PCR扩增特异性基因片段
三、DNA克隆片段分离的方法
1. 利用限制性内切酶片段化基因组DNA 鸟枪法（shotgun approch）：用限制 性内切酶消化给体基因组DNA，这种消 化产物，不经过凝胶电泳分部分离，就 直接用来同载体分子作连接反应的克隆 方法。 2. 凝胶电泳法和蔗糖梯度离心法分离
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才 能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新 的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般 是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限 制性内切酶和甲基化酶的突变株。
转化的方法：
1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂 （如CaCl2）制备的感受态细胞，通 过热击处理将载体DNA分子导入受 体细胞；
2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗 制备的感受态细胞，通过高压脉冲 的作用将载体DNA分子导入受体细 胞。
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如： CaCl2 ， RuCl 等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许 多有外源DNA的载体分子通过的感受态 细胞(competent cell)
转化的原理与技术：
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革 兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970 年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经 热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空 隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备： 100ml菌体培养至OD600= 0.5，离心收集菌体 用10 ml冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心
电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞 壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验
转染 是指转化感染（Transfection来自于 transfomation与infection） 凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载 体，以转化的方法将DNA导入细胞的 方法均称为转染。因此转染就方法来 说与转化是一样的。
λ噬菌体DNA的转染
感受态细胞的培养
将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和 MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保 温10分钟 转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时， 直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选