实验八亲和层析分离纯化蛋白质

5．用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。 6．PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7．用分光光度计测定每一管的吸光度值，
记录读数，绘制洗脱曲线。
8．将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
一、实验原理
• 蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消 除了蛋白质间原有的电荷差异。
实验目的
• 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋 白的原理和实验方法（第一部分）
• 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理 和方法（第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
一、实验原理
亲和层析
生物大分子与配体特异非共价可逆结合。
• 酶-底物或底物类似物 • 抗体-抗原 • 激素-受体 • 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 • 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）
（四）装GST柱子
1．清洗和装好层析柱，封闭出口。 2．加入2 mL PBS。 3．用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。 4．打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。
（五）纯化目的蛋白 1．用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2．将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3．用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4．加入1ml 洗脱液。
10% 过硫酸铵（AP） 总体积
12%分离胶 2.5 ml 3.0 ml 2.0 ml 75 ul 10 ul 75 ul 7.5 ml
• 按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻 摇匀，迅速加入两块玻璃板间。
• 在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚 合15 min，至分离胶与水之间出现一条清 亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残 余的水。
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
5．每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ul Marker。
6．50V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将 电压调节到80V，电泳2-3h。
7．等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。
8．撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内， 加入染色液，染色30min。
1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上 样缓冲液。
2号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上样缓冲液
3号样，蛋白质分子量标准，老师准备。
3．制作5.0%浓缩胶
按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白 质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。
二、实验步骤
1．洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干， 安装制胶器。
2．根据下列配方制作12%分离胶。
12%分离胶
试剂名称 蒸馏水
30% 丙烯酰胺（29:1） 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
GSH- Sepharose 4B
外源蛋白的表达和纯化
二、实验步骤
（一）目标蛋白诱导表达和菌体收集
1．0.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白 表达，28℃，200 rpm培养3-6 h。
2．5000 rpm离心5 min，倒掉上清。
3．沉淀加40 ml水，5000 rpm离心5 min。
（二）细胞破碎 1．倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。 2．破碎菌体，超声波2 min，停止1 min。
（菌液始终保持在冰浴中）
3．重复8-10遍，百度文库至菌液清澈。
（三）离心
1．每个小组分取1-2 ml细胞破碎液， 12000 rpm，离心5 min。
2．分取50 uL上清液，4℃保存。 3．其余的上清液准备过GST柱子。