实验八亲和层析分离纯化蛋白质
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
3．制作5.0%浓缩胶
按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
蛋白共纯化实验报告
1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握利用亲和层析法进行蛋白质共纯化的技术。
3. 通过实验验证蛋白质共纯化的效果。
二、实验原理蛋白质共纯化是指从混合蛋白质样品中同时分离和纯化两种或两种以上的目的蛋白。
亲和层析法是蛋白质共纯化常用的技术之一，其原理是利用蛋白质与特定配体的亲和力，通过柱层析将目的蛋白从混合样品中分离出来。
三、实验材料1. 试剂：亲和层析柱、亲和配体、洗脱液、样品缓冲液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝染色液等。
2. 仪器：离心机、层析柱、凝胶成像仪等。
四、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和配体固定在层析柱上，制成亲和层析柱。
2. 样品处理：将混合蛋白质样品加入亲和层析柱，进行预平衡。
3. 亲和层析：将样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
4. 洗脱：用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
5. 检测：将洗脱液进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的纯度。
6. 收集目的蛋白：将SDS-PAGE凝胶上的目的蛋白条带切割下来，进行后续处理。
五、实验结果与分析1. 亲和层析柱制备成功，亲和配体固定在层析柱上。
2. 样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
3. 用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
4. SDS-PAGE分析结果显示，洗脱液中含有目的蛋白，且纯度较高。
通过亲和层析法进行蛋白质共纯化实验，成功分离和纯化了两种目的蛋白，验证了实验方法的有效性。
七、实验注意事项1. 亲和层析柱制备过程中，要注意配体的固定量和固定效果。
2. 样品处理过程中，要确保样品溶液的浓度适宜，避免样品过浓或过稀。
3. 亲和层析过程中，要注意控制洗脱液的pH值和离子强度，以保证目的蛋白的稳定性。
4. 实验过程中，要注意层析柱的清洗和保存，避免污染。
5. 实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，总结实验结果。
亲和层析纯化蛋白注意事项
亲和层析纯化蛋白注意事项以亲和层析纯化蛋白注意事项为标题，写一篇文章。
亲和层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过蛋白与配体之间的特异性相互作用，实现目标蛋白的分离纯化。
在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，有一些注意事项需要我们特别关注。
选择合适的亲和层析柱非常重要。
不同的亲和层析柱具有不同的亲和基团，可以与不同的目标蛋白发生特异性相互作用。
在选择亲和层析柱时，需要考虑目标蛋白的性质，如分子量、等电点、亲和基团的配对等。
同时，还需要考虑目标蛋白与其他非特异性结合物的亲和性，以便在纯化过程中有效去除杂质。
样品的预处理也是亲和层析纯化蛋白的关键一步。
在样品中含有大量的杂质，如其他蛋白、核酸、小分子化合物等。
这些杂质会影响到目标蛋白与亲和基团的结合，降低纯化效果。
因此，在进行亲和层析纯化之前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、浓缩目标蛋白等。
在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，温度和pH值的控制也是非常重要的。
温度和pH值可以影响到目标蛋白与亲和基团之间的结合力和特异性。
一般来说，选择适当的温度和pH值可以增强目标蛋白与亲和基团的结合，提高纯化效果。
同时，还需要注意避免温度和pH值对目标蛋白的稳定性产生不利影响。
洗脱缓冲液的选择也是亲和层析纯化蛋白时需要注意的地方。
洗脱缓冲液的选择应根据亲和基团与目标蛋白的结合力以及目标蛋白与非特异性结合物的结合力来确定。
通常，使用一系列浓度递增的洗脱缓冲液可以有效地去除非特异性结合物，提高纯化效果。
但是，洗脱缓冲液的浓度也不能太高，否则可能会影响到目标蛋白的活性和稳定性。
对于亲和层析纯化蛋白的结果评价也是需要注意的。
在纯化过程中，可以通过检测目标蛋白的纯度、活性以及其他相关特性来评价纯化效果。
同时，还需要对纯化后的目标蛋白进行保存和储存，以保证其在后续实验中的可用性和稳定性。
亲和层析纯化蛋白是一种常用的蛋白纯化方法，但在实验过程中需要注意一些细节。
包括选择合适的亲和层析柱、样品的预处理、温度和pH值的控制、洗脱缓冲液的选择以及结果的评价等。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰 好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出 口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部 进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
在装柱过程中凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱装柱结束后其凝胶表面应平整2021610取4mgml蓝色葡聚糖溶液6mgml细胞色素c溶液2mgml重铬酸钾溶液各6滴混合即为上柱样品
实验八 凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 分子排阻层析(molecular exclusion chromatography) 分子筛层析(molecular sieve chromatography) 凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)
不要使平 整的床表 面搅动
实验操作
4、洗脱和收集
调节蠕动泵流速，使得进水速度 0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流 速0.3ml/min， 取小试管20支，每管 收集1ml，观察两种颜色出现的管号。
不能 让凝 胶表 面露 出水 面
实验操作
5、绘制洗脱曲线。
五、注意事项
根据实验中遇到的各种问题，总结做好 本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录：HPLC高压液相色谱
附录：凝胶过滤常用填料
分离纯化蛋白质的方法及原 理
（2） 利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。
但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。
1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。
因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。
在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。
不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。
当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。
这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。
球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。
当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。
当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。
盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。
此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。
蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。
盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
蛋白质的表达纯化
400ul
750ul
1800ul
50ul
10ul
灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
01
加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）
5ml
3ml
4ml
120ul
20ul
30%Arc-Bis
Tris-HCl pH 6.7
H2O
10%AP
6
稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。
7
注意事项
将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。
氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。
氨苄青霉素：100mg/mL
Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，利用目标蛋白与具有亲和作用的亲和基团结合，将目标蛋白从复杂的混合物中分离出来。
亲和基团通常是与目标蛋白有特异结合的小分子，如金属离子、抗体、亲和标签等。
在亲和层析过程中，将这种具有亲和基团的亲和剂固定在某种固相材料上，如琼脂糖或磁珠等。
将混合物加入亲和剂固定的层析柱中，目标蛋白与亲和基团结合，其他非特异结合的成分则通过柱子流过。
随后，通过改变缓冲条件或添加竞争性亲和剂，将目标蛋白从亲和基团上进行洗脱，最终得到纯化后的目标蛋白。
亲和层析蛋白纯化方法简单易行，纯化效果好，但也有一些局限性，如亲和基团的选择对纯化效果有很大影响，目标蛋白与亲和基团的结合力可能不够牢固，而且纯化过程中可能会有非特异结合的蛋白质被误纯化。
因此，在选择亲和层析方法时需要根据目标蛋白的特性及需求进行合理选择。
蛋白纯化亲和层析分离技术
蛋白纯化亲和层析分离技术每一种新思想形成的背后都在积极面对“死胡同”时失落；每一种新方法的产生也在处处留心每跨一步留下的脚印；就像不积跬步无以至千里，不积小流无以成江海，一点一点的走心劳动，时间会在某个点积累汇聚，来到你想要的时刻。
这篇文章的主角是蛋白纯化亲和层析技术，在此概述了蛋白纯化亲和吸附层析的原理、应用等，该技术同样经过多年的慢慢演变过程，中间经历了前人的经验和智慧，才发展形成现在的一种新技术，1910年时，淀粉吸附淀粉水解酶；1951年，免疫吸附剂能够分离抗体；1967年，胰蛋白酶的不容酶提纯胰蛋白酶抑制剂。
所以，给予你的实验，包括时间、经历、探索、思维、心态，慢慢磨练，等待想要的实验结果。
——致终在实验台边奋斗的你一滴小水滴，也在映射着大海的样子后来隔了很久很久，故事的结局：正如你看到蛋白质亲和层析技术适应于理化性质差异性较小而难分离的蛋白质，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析住。
它通常只需要一步操作便能将目的蛋白从混合物中分离出来，并且纯度很高。
蛋白纯化亲和层析的固相载体具有稳定的理化学性质，是一种含有较多化学反应基团的羟基多糖类介质，具有机械强度高，透性好，不溶于水，非特异性吸附少，多孔网状结构的特点。
常用的载体有琼脂糖凝胶，其他的载体如葡聚糖凝胶，多孔硅胶，树脂，纤维素等，固相载体首先与特定的配体共价偶联形成具有化学活性的基团，即载体的活化，常见的有溴化氰活化载体，即将含有氨基偶联到载体的多糖基上，以及环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体，其他的载体的活化剂还有戊二醛等。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。
蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。
下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。
1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。
先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。
使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。
2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。
它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。
原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。
该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。
3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。
其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。
4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。
超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。
5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。
配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。
原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。
6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。
利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。
亲和层析纯化重组蛋白
亲和层析纯化重组蛋白【实验目的】学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白。
【实验原理】利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性,(Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag,则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化,经过低浓度咪唑溶液洗涤后,可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。
【器材与试剂】1.实验仪器摇床,高速冷冻离心机,超声波细胞破碎仪,微量移液器,电泳仪,蛋白电泳槽2.实验试剂蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2,镍离子螯合树脂(His.Bind Resin,美国Novagen公司),结合缓冲溶液:0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,20 mmol/LTris-Cl,pH8.0;洗涤缓冲液: 0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,20 m mol/L Tris-Cl,pH8.0;洗脱缓冲液:0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑,20 mmol/L Tris-Cl,pH8.0;30%凝胶贮液:29% 丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10% 十二烷基硫酸钠(SDS),N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED), 10%过硫酸铵,标准分子量蛋白,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1% SDS,pH8.3;1.5mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS, 10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸3.实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)(工程菌)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内,待凝胶沉淀且保护剂流净后,用10 mL蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液,待其流干净后,用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
实验步骤
6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子， 液面应该完全没过电极。
7、点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点 30ul样品，每板胶点5ul Marker。
加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合 8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V； 9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束 10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记， 放在塑料盒内，加入染色液， 染色30min左右。 11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。
洗脱的蛋白溶液（3号管）25uL， 加5uL 5X上样缓冲液。
点样前沸水中加热3-5min。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理 和方法
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了 各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
1、用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2、将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3、用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4、加入1ml 洗脱液。 5、用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集
0.2ml（约4滴）。 6、PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7、将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。
※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 ※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis (29:1) 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS TEMED（加速剂） 10% APS（催化剂，最后加）
亲和层析在蛋白质纯化中的应用.docx
亲和层析在蛋白质纯化中的应用.docx亲和层析在蛋白质纯化中的应用亲和层析(affinity chromatography, AC) 是一种简单易操作的生物大分子分离纯化的重要方法之一，它的基本原理是将与待分离纯化的目标产物具有亲和力的亲和配体固定在载体上(比如说，常用载体有琼脂糖、壳聚糖、纤维素、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等)，利用目标产物与亲和配体之间的特异性亲和力，使得亲和配体选择性地结合目标产物，从而达到分离纯化的目的。
亲和层析主要包括四个步骤：(1)制备亲和层析柱;(2)样品裂解液与亲和层析柱结合;(3)将杂质洗出;(4)洗脱目标产物。
亲和层析因具有简单易操作、选择性高、载量大以及分离纯化的蛋白纯度较高等优点，因而被广泛应用于在生物大分子的纯化，如结合蛋白、酶、抗体、抗原、DNA、RNA、病毒、细胞等生物大分子的纯化。
本文就亲和层析在近几年蛋白质纯化中的应用作一介绍。
1 亲和层析的类型亲和层析的类型主要有：生物亲和层析(BAFC)、免疫亲和层析(IAFC)、固定化金属离子亲和层析(IMAC)、拟生物亲和层析(BMAFC)以及特殊基团亲和层析等。
科研人员可以根据自己实验的实际需要选择相应的亲和层析方法来达到实验目的。
2 亲和层析在蛋白纯化中的应用蛋白的分离纯化是蛋白组学研究中一个非常重要的环节，蛋白质能否有效的分离纯化关系到整个实验的成败。
2011年Arnold等用有机小分子1A4，2A8，2A9以及2A10作为亲和配体，与N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B)共价结合制备成亲和层析柱，纯化了不同的抗体，其中以2A10作为亲和配体所制得的亲和层析柱纯化得到的抗体产率大于90%，纯度大于80%，这与以蛋白A为配体亲和纯化的抗体的产率和纯度相当，然而小分子为配体的亲和层析柱却解决了以蛋白A为配体易污染、不稳定的难题。
乙酰胆碱酯酶维持乙酰胆碱在动物体内平衡起着非常重要的功能作用，对乙酰胆碱酯酶的研究有着极其深远的意义。
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• 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋 白的原理和实验方法（第一部分）
• 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理 和方法（第二部分）
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
一、实验原理
亲和层析
生物大分子与配体特异非共价可逆结合。
• 酶-底物或底物类似物 • 抗体-抗原 • 激素-受体 • 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 • 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）
（二）细胞破碎 1．倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。 2．破碎菌体，超声波2 min，停止1 min。
（菌液始终保持在冰浴中）
3．重复8-10遍，直至菌液清澈。
（三）离心
1．每个小组分取1-2 ml细胞破碎液， 12000 rpm，离心5 min。
2．分取50 uL上清液，4℃保存。 3．其余的上清液准备过GST柱子。
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
GSH- Sepharose 4B
外源蛋白的表达和纯化
二、实验步骤
（一）目标蛋白诱导表达和菌体收集
1．0.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白 表达，28℃，200 rpm培养3-6 h。
2．5000 rpm离心5 min，倒掉上清。
3．沉淀加40 ml水，5000 rpm离心5 min。
• 当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白 质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。
二、实验步骤
1．洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干， 安装制胶器。
2．根据下列配方制作12%分离胶。
12%分离胶
试剂名称 蒸馏水
30% 丙烯酰胺（29:1） 1.5M Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
5．每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ul Marker。
6．50V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将 电压调节到80V，电泳2-3h。
7．等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。
8．撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内， 加入染色液，染色30min。
10% 过硫酸铵（AP） 总体积
12%分离胶 2.5 ml 3.0 ml 2.0 ml 75 ul 10 ul 75 ul 7.5 ml
• 按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻 摇匀，迅速加入两块玻璃板间。
• 在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚 合15 min，至分离胶与水之间出现一条清 亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残 余的水。
（四）装GST柱子
1．清洗和装好层析柱，封闭出口。 2．加入2 mL PBS。 3．用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。 4．打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。
（五）纯化目的蛋白 1．用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2．将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3．用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4．加入1ml 洗脱液。
1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上 样缓冲液。
2号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上样缓冲液
3号样，照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
5．用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。 6．PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7．用分光光度计测定每一管的吸光度值，
记录读数，绘制洗脱曲线。
8．将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
一、实验原理
• 蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消 除了蛋白质间原有的电荷差异。