工业微生物育种

工业微生物育种简介刘春波-12生工2-20120802224摘要：本文综述了工业微生物遗传育种的历史地位，介绍了遗传育种的方法和机理，并对其前景进行了展望。

微生物遗传育种，所谓微生物遗传育种，即菌种改良，是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法[1]，使我们获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，其目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

关键词：工业微生物；遗传育种；方法；机理工业微生物菌株选育在工业发酵中占有重要地位。

用于工业生产的微生物菌种，最好具有以下特征：1.在遗传上必须是稳定的。

2.易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体3.必须是纯种，不应带有其它杂菌及噬菌体。

4.种子的生长必须旺盛、迅速。

5.产生所需要的产物时间短。

6.比较容易分离纯化。

7.有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。

8.能保持较长的良好经济能力。

9.菌株对诱变处理较敏感，从而提高产量潜力高[2]。

1 历史地位菌种选育技术的广泛应用为我们提供了各种类型的突变菌株，使得在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开发等领域产生众多新的产品，促使传统产业的技术改造和新型产业的产生，同时使诸如抗生素、有机酸、维生素、色素、生物碱、激素以及其它生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千万倍地增长，并且产品的质量也不断的提高。

与此同时链霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等抗生素也大规模的生产起来；在代谢控制育种的推动下使得产氨基酸、核苷酸、有机酸等次生代谢产物的高产菌株大批投入生产；由基因工程构建的工程菌株使得微生物次生代谢产物生产能力迅速提高，而且生产出微生物本生不能生产的外源蛋白质，如胰岛素、生长激素、单克隆抗体和细胞因子等等。

由此可见工业微生物遗传育种技术是工业发酵工程的核心技术，在其作用下人们获得了许多的高产优质菌株，为生产实践发展起了强大的推动作用。

2 机理及方法2.1 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。

这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。

所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。

互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配[3]。

自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。

为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。

在工业生产上，由于各种条件因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平的波动，所以技术人员很注意从高生产水平的批次中，分离高生产能力的菌种再用于生产。

同时也可利用自发突变而出现的菌种性状的变化，去选育优良的菌株，如在味精发酵被噬菌体污染过程中，所选出的抗噬菌体菌株。

自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。

但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。

酒精发酵是最早应用微生物遗传学原理于微生物育种实践，推广了自然选育的纯系良种，扭转了酒精生产不稳定的现象。

这是最早应用微生物遗传学原理，进行育种实践，提高发酵水平的一个实例[4]。

这样低的突变率导致自然选育耗时长，工作量大，影响了育种工作效率，在这种情况下，出现了诱变育种技术。

2.2 诱变育种微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱变微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最合适的环境下合成有效产物[2]。

诱变育种和其他育种方法相比，具有速度快、收益大、方法简单等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，在生产中使用的十分普遍。

但是诱变育种缺乏定向性，因此诱变突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。

目前，人们用于诱变育种的诱变因素有物理因素和化学因素，前者包括紫外线、激光、X-射线、γ-射线和中子等；后者主要是烷化剂(包括EMS，EI，NEU，NMU，DES，MNNG，NTG等)，天然碱基类似物，亚硝酸和氯化锂等。

在物理诱变因素中，紫外线比较有效、适用、安全，其他几种射线都是电离性质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性，化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎[1]。

目前，多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定，人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂以达到预期的育种效果。

诱变育种也可采用复合诱变，即两种或多种诱变剂的先后使用同种诱变剂的重复作用；两种或多种诱变剂的同时使用。

普遍认为复合诱变具有协同效应，如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用，复合诱变较单一诱变效果好。

虽然复合因子较单一因子诱变效果有很大优势，但因为目前大多微生物，尤其是抗生素产生菌的遗传背景不清楚，往往对诱变剂，特别是复合诱变剂的选择使用，带有很大的盲目性[6]。

通过诱变处理，在微生物群体中，会出现各种突变型个体，但从产量变异的角度来讲，其中绝大多数都是负变株。

要从中把极个别的、产量提高较显著的正变株筛选出来，可能要比沙里淘金还难。

因此突变株的分离和筛选是诱变育种的关键，体现了突变不定向性和筛选定向性。

为了获得我们所需的突变株，使得突变株的新表型得以表达，淘汰原养型或负变株，必须设计一个良好的筛选培养基和确定合适的培养条件。

筛选的步骤主要分初筛和复筛，初筛以量为主，选留较多有生产潜力的菌株，复筛以质为主，对少量潜力大的菌株的代谢产物量进行精确测定[7]。

筛选的方法依据目的物不同而异，常用的方法有浓度梯度法、影印平板法、生长谱法、琼脂平板活性圈法、纸片法、夹层培养法、循环筛选法以及与电脑化、智能化的高效筛选技术相结合的现代方法。

2.3 杂交育种杂交是指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。

杂交育种是利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式，而导致其菌株间的基因的重组，把亲代的优良性状集中在后代中的一种育种技术。

通过杂交育种可以实现不同的遗传性状的菌株间杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，获得新的品种。

同时不仅可克服因长期诱变造成的菌株活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应[2,8]。

本小节将从有性杂交、准性杂交和原生质体融合三种常见的育种技术来介绍杂交育种。

2.3.1 有性杂交有性杂交是指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。

凡能产生有性孢子的真菌，原则上都能像高等动、植物杂交预育种相似的有性杂交方法来进行育种[7]。

一般方法是把来自不同亲本、不同性别的单倍体细胞通过离心等方式使之密集地接触，就有更多的机会出现种种双倍体的有性杂交后代。

在这些双倍体杂交子代中，通过筛选，就可以得到优良性状的杂种。

2.3.2 准性杂交准性杂交是在无性细胞中所有的非减数分裂导致DNA重组的过程，微生物杂交仅转移部分基因，然后形成部分重组子，最终实现染色体交换和基因重组，在原核和真核生物中均有存在。

准性杂交的方式主要有结合、转化和转导，其局限性在于等位基因的不亲合性。

2.3.3 原生质体融合原生质体融合就是把两个不同亲本菌株的细胞壁，分别经酶解作用去除，而得到球状的原生质体，然后将两种不同的原生质体置于高渗溶液中，由聚乙二醇（PEG）助融，促使两者高度密集发生细胞融合，进而导致基因重组，就可由此再生细胞中获得杂交重组菌株[9]。

原生质体融合技术具有许多常规杂交方法无法比拟的独到之处[10]:由于去除了细胞壁，原生质体膜易于融合，即使没有接合、转化和转导等遗传系统，也能发生基因组的融合重组；融合没有极性，相互融合的是整个胞质与细胞核，使遗传物质的传递更为完善；重组频率高，易于得到杂种；存在着两株以上亲株同时参与融合并形成融合子的可能[11]；较易打破分类界限，实现种间或更远缘的基因交流[12]；同基因工程方法相比，不必对试验菌株进行详细的遗传学研究，也不需要高精尖的仪器设备和贵的材料费用等。

由于以上优点，迄今，这项技术不仅在基础研究方面，而且在实际应用上，均取得了引人注目的成绩。

随着生物学研究手段的不断创新，该技术的基本实验方法逐步完善。

经过多年的实际应用，证明微生物原生质体融合确是一项十分有用的育种技术[13]。

通过原生质体融合改良工业微生物菌株的遗传本质是培育高产、优质、抗逆性强的良种的一种行之有效的手段，可以与诱变育种等结合使用，同时还需要不断积累有关基础资料，克服育种盲目性，以期达到工业生产的新需求。

1960年法国的Barsi[14]研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada[15]发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。

1974 年匈牙利的Fereczy[16]采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Creotrichumcandidum)营养缺陷型突变株原生质体的融合; 随后人们相继用NaCl、KCl Ca( NO3) 2等作为诱变剂进行融合，但融合率比较低; 1978 年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题，使这一技术迅速扩展到了育种领域; 1979 年匈牙利的Pesti[17]首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量，从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用。

原生质体融合育种基本步骤为：标记菌株的筛选和稳定性验证→原生质体制备→等量原生质体加聚乙二醇促进融合→涂布于再生培养基，再生出菌落→选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏→生产性能筛选。

3 展望工业微生物遗传育种在基因工程、细胞工程、蛋白质工程和酶工程等现代生物技术的支持下，创造出许许多多的设计技巧、科技含量高、目的性强、劳动强度低、效果显著的育种方法，为人类获得稳定性好、高产、新种类的工程菌株和开发新药和工业产品，以及提高产品产量和质量提供了有力的保障。

我们有理由相信微生物遗传育种学将得到更加全面的纵横发展，将为生产实践提供更多的优良菌株，将在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开发等领域发挥更加重要的作用。

参考文献[1] 陈三凤，《现代微生物遗传学》[2]《谈谈你对工业微生物育种的看法》2008，08.[3] 贺淹才.基因工程技术指南「M」..北京:科学出版社,1998, 92[4] 施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学[M].2 版,北京:科学出版社,2003: 2- 3[6] 黄大肪,林敏.农业微生物基因工程．北京：科学出版社，2001.[7] 吴乃虎.基因工程原理「M」．.北京: 科学出版社（第二版）[8] 沈祖嘉,沈仁权.分子遗传学「M」．上海：复旦大学，1988[9] 施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学[M].北京:科学出版社,2003[10] 王付转，梁秋霞，李宗伟. 诱变和筛选方法在微生物育种中的应用[J]. 洛阳师范学院学报，2002，2：95-99.[11] 周德庆.微生物学教程[M].北京:高等教育出版社,2002, 202[12] Kao K N .A method for high-frequency intergeneric fusion ofplant protoplast[J]. Planta，1974，115：355-367.[13] Hopwood D A，Wright H M.Genetic recombination throughprotoplast fusion in Streptomyces[J]. J GenMicrobiol，1979，111(1)：137-143.[14] Barski G,Hebd C R.Seance8 Acid Sci. [M].Oxford:Blackwell,1960:1825 - 1827[15] Okuda Y.Exp cell[M].NewYork:Academic Press,1962:98- 107[16] Fereaczy L.Curreat microbiol[M].London:Cambridge UniversityPress,1980:550- 574。