软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择
sirna转染常见问题解答
siRNA转染常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna（小体RNA）技术是一种新型的分子技术，可以靶向性地抑制某些特定基因，用于研究基因表达、调节合成物质和活性蛋白质的水平，以及治疗细胞病毒学和遗传学疾病。
Sirna转染作为许多基因治疗方法的关键技术，可以有效地将Sirna片段迅速、安全地转染到细胞内，为研究和治疗提供新的途径。
本文就Sirna转染原理及其在基因治疗中的应用进行综述。
Sirna转染原理Sirna转染的原理是利用Sirna片段在细胞中进行有效的“封锁”，封锁被封锁基因的表达，从而达到调节基因表达的目的。
Sirna片段是由特定的RNA序列组成，长度为19-25个核苷酸，能够结合到mRNA，形成mRNA-Sirna复合物。
当其复合后，mRNA的解读将受到抑制，而蛋白质的合成也将减少，从而达到调节基因表达的目的。
Sirna转染的方法Sirna转染具有多种方法，包括化学递送、化学封装和抗体介导等。
1.学递送化学递送是最常用的Sirna转染方法，典型的化学递送剂有三聚脂散（Lipofectamine）、一及二聚脂散（Lipofectin）、二乙醇胺（DEAE）等。
化学递送剂能够有效地将Sirna片段递送到细胞内，可以提供最大的转染效率。
2.学封装化学封装技术是把Sirna溶解在定制的化学封装剂中，形成脂质微粒，然后将其投放到细胞内以进行转染。
相比常规的化学方法，化学封装有更强的转染能力，可以在短短几分钟内转染细胞；但由于它的转染效率取决于封装剂的组成，所以任何实验室都可以自行封装Sirna转染剂，这会极大地缩短转染时间。
3.体介导抗体介导转染是把Sirna片段结合到特定抗体上，然后利用抗体来将Sirna片段递送到细胞内，通过细胞内抗体受体，将Sirna片段发送到细胞内，从而达到抑制特定基因表达的目的。
采用抗体介导转染技术，可以实现更高的转染效率，还能保护Sirna片段不受酶的侵扰，让转染的Sirna片段有更好的活性。
sirna转染原理
sirna转染原理siRNA转染原理。
siRNA（small interfering RNA）是一种短链RNA分子，可以在细胞内特异性地沉默基因表达。
siRNA转染作为一种常用的实验技术，被广泛应用于基因功能研究、药物靶点筛选和疾病治疗等领域。
siRNA转染的原理是通过siRNA分子的引导，将特定基因的mRNA降解，从而抑制该基因的表达。
下面将详细介绍siRNA转染的原理及其在实验中的应用。
首先，siRNA转染的原理是基于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的机制。
当siRNA分子进入细胞内后，它会与RISC（RNA-induced silencing complex）结合，形成siRNA-RISC复合物。
siRNA-RISC复合物会识别并结合到靶基因的mRNA上，然后RISC中的核酸酶活性将靶mRNA特异性降解，从而导致该基因的表达受到抑制。
其次，siRNA转染的关键在于siRNA分子的设计。
siRNA通常由21-23个碱基组成，其中包括一个“sense”链和一个“antisense”链。
这两条链通过互补配对形成双链结构，其中antisense链与靶基因的mRNA序列互补配对，从而介导mRNA的降解。
在siRNA设计过程中，需要避免与其他基因的mRNA序列互补配对，以确保siRNA的特异性。
另外，siRNA转染的效率受到细胞内siRNA释放和稳定性的影响。
siRNA需要通过转染试剂或载体进入细胞内，然后被释放到细胞质中。
在细胞内，siRNA还需要避免被核酸酶降解，以保持其稳定性和活性。
因此，选择合适的转染试剂和siRNA转染条件对于siRNA转染的效果至关重要。
最后，siRNA转染在实验中的应用包括基因沉默实验、基因功能研究、药物靶点筛选和疾病治疗等。
通过siRNA转染，研究人员可以有针对性地沉默特定基因，观察其对细胞功能和生物学过程的影响，从而揭示基因的功能和调控机制。
此外，siRNA转染还被应用于药物靶点的筛选和疾病治疗研究中，为新药的研发和临床治疗提供重要的实验依据。
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。
除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。
如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的转染效率。
转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。
金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来，发挥抑制基因表达的作用。
通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。
因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。
目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明一、简介siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种短双链RNA分子，能够特异性地靶向靶标基因的mRNA，从而抑制基因的表达。
本文档旨在提供有关siRNA的使用说明，包括实验准备、转染方法、验证转染效果等内容。
二、实验准备1、设计siRNA序列：根据目标基因序列，使用专业软件设计siRNA序列，确保合适的靶向位点和抑制效果。
2、合成siRNA：选取可靠的siRNA合成公司，按照其提供的合成方案进行合成，并确保纯度和浓度的准确性。
3、存储siRNA：将合成好的siRNA按照要求进行冻干或溶解保存，避免反复冻融对siRNA的影响。
三、细胞培养1、细胞系选择：选择适合的细胞系进行实验，一般常用的细胞系有HEK-293、HeLa、CHO等。
2、培养条件：按照细胞系的要求，配置好适合的培养基，并添加适当的血清和抗生素。
3、培养状态：维持细胞在良好的状态下生长，保持培养皿内细胞的完整和无菌。
四、siRNA转染1、转染试剂选择：根据不同细胞系的特点，选择适合的转染试剂，如RNMAX、Lipofectamine等。
2、转染条件优化：通过实验室预实验，优化转染试剂的用量、培养时间和上清液收集时间等参数。
3、转染操作步骤：a：将siRNA转染试剂溶解于无血清的培养基中，按照转染试剂说明书的推荐比例进行稀释。
b：将稀释后的转染试剂静置15-30分钟，直至形成转染试剂- siRNA复合物。
c：将复合物滴加到细胞培养皿中，保持培养皿在37°C的培养箱中进行适当的培养时间。
d：收集转染后的上清液，进行进一步的实验。
五、转染效果验证1、Real-time PCR：使用逆转录酶和合适的引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因表达水平的变化。
2、Western blot：通过Western blot实验检测目标蛋白的表达水平是否下调。
3、免疫荧光染色：利用免疫荧光染色技术观察目标蛋白在细胞中的表达情况。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种:1。
磷酸钙共沉淀将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子.将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染.4。
机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪(biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5。
阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体.这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同.使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA—阳离子脂质体复合物。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的基因沉默技术，通过引入特定的小干扰RNA (siRNA) 分子来抑制目标基因的表达。
本文将介绍细胞siRNA转染的操作流程，以及该技术的应用和优势。
二、材料与方法1. 细胞培养：选择合适的细胞系，如人类癌细胞系HeLa，细胞应保持在优良的培养条件下，并处于快速增殖期。
2. 转染试剂：选择适合的转染试剂，如lipofectamine 2000等，根据试剂说明书进行操作。
3. siRNA设计与合成：根据目标基因序列设计合适的siRNA，确保siRNA具有高效的靶向作用和沉默效果。
4. 细胞培养基和缓冲液：准备含有适当浓度的无血清培养基和缓冲液。
三、操作流程1. 处理细胞：将细胞用适量的培养基悬浮在培养皿中，使细胞密度达到合适的转染浓度，一般为60-80%的细胞密度。
2. siRNA与转染试剂复合：将设计好的siRNA与转染试剂按照试剂说明书中的比例混合，并在室温下静置一段时间使其形成复合物。
3. 转染操作：将复合物缓慢滴加到细胞培养皿中，轻轻摇晃培养皿以保证复合物均匀分布在细胞上。
4. 培养细胞：将培养皿放入培养箱中，以适当的条件（如37℃，5% CO2）培养细胞一定时间，以便siRNA能够有效进入细胞并起到沉默目标基因的作用。
5. 细胞分析：根据实验需要，在转染后一定时间内收集细胞，进行相应的实验分析，如蛋白质检测、细胞增殖实验等。
四、应用与优势细胞siRNA转染技术广泛应用于生命科学研究中，可用于研究基因功能、新药靶点筛选、疾病机制探究等领域。
该技术的优势在于操作简便、效率高、靶向性强，并且可用于多种细胞系，适用范围广泛。
五、结论细胞siRNA转染是一种重要的基因沉默技术，通过引入siRNA分子抑制目标基因的表达。
本文介绍了细胞siRNA转染的操作流程和相关应用及优势。
随着该技术的不断发展，相信它将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明1.介绍siRNA（小干扰RNA）是一种能够特异性沉默靶基因表达的双链RNA分子。
本文档旨在提供关于siRNA的详细使用说明，包括实验前准备、实验步骤和数据分析等内容。
2.实验前准备2.1 选择siRNA：选择适合的siRNA靶向靶基因。
可以通过文献研究或生物信息学预测来确定siRNA的序列。
2.2 siRNA合成与纯化：合成和纯化siRNA应该由可靠的供应商进行。
确保合成的siRNA纯度高且无附加污染物。
2.3 细胞培养：选用适当的细胞系，并且按照常规细胞培养方法将其培养在适宜的培养基中。
3.实验步骤3.1 载体转染：将siRNA与特定的转染试剂混合，并按照转染试剂的说明书将其转染入细胞中。
注意控制组设置。
3.2 RNA干扰效率检测：根据靶基因的表达情况选择适当的方法检测siRNA的干扰效果，如定量PCR或Western blot等。
3.3 功能检测：根据实验需要，选择适当的功能检测方法，如细胞增殖、凋亡、迁移或侵袭等。
4.数据分析4.1 干扰效果分析：对实验结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并计算干扰效果的百分比。
4.2 功能检测结果分析：对功能检测结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并进一步解释其生物学意义。
5.附件本文档涉及的附件包括实验记录表、数据分析表和相应的图表。
请在需要时参考附加的文件。
6.法律名词及注释6.1 siRNA：小干扰RNA，一种双链RNA分子，用于特异性沉默靶基因表达。
6.2 RNA干扰：通过siRNA分子的特异性结合和降解，抑制靶基因的转录和翻译过程。
6.3 转染：将外源DNA或RNA导入靶细胞以实现外源基因的表达或干扰基因的沉默。
6.4 培养基：一种用于细胞培养的含有营养物质和生长因子的液体或固体培养基质。
7.结束语感谢您阅读本siRNA使用说明，希望本文档能帮助您顺利进行siRNA实验。
细胞sirna转染操作流程
细胞sirna转染操作流程细胞siRNA转染操作流程一、引言细胞siRNA转染是一种常用的实验技术，用于研究基因功能和调控机制。
siRNA是一种短小的RNA分子，可以通过特定的转染方法送入细胞内，从而实现对特定基因的沉默。
本文将详细介绍细胞siRNA转染的操作流程。
二、实验前的准备1. 准备所需材料：包括细胞培养基、细胞培养器具、siRNA转染试剂、转染缓冲液等。
2. 培养细胞：将目标细胞培养至对数生长期，并确保细胞状态良好。
三、细胞siRNA转染操作流程1. 细胞处理a. 将细胞分装至培养皿中，使其达到适当的细胞密度。
b. 按照转染试剂的说明书，制备合适的转染混合液。
2. 转染操作a. 将转染混合液缓慢滴加至培养皿中，使其均匀分布在细胞上。
b. 轻轻摇晃培养皿，使转染混合液与细胞充分接触。
c. 将培养皿放回培养箱中，继续培养。
3. 转染后的处理a. 根据实验设计，确定转染后的时间点。
b. 在规定的时间点，进行下一步实验操作，如蛋白质表达分析、细胞功能研究等。
四、结果分析与讨论根据实验设计和细胞siRNA转染的目的，对实验结果进行分析和讨论。
可以通过Western blot、实时荧光定量PCR等技术手段来验证基因沉默效果，并进一步研究其对细胞功能的影响。
五、实验注意事项1. 选择适当的转染试剂和转染缓冲液，确保转染效率和细胞存活率。
2. 控制转染试剂的用量，避免过度转染导致细胞毒性。
3. 严格按照实验设计和操作流程进行实验，减少操作误差。
4. 注意实验室安全，遵守相关实验操作规范。
六、结论细胞siRNA转染是一种重要的实验技术，可以用于研究基因功能和调控机制。
通过合理的实验设计和操作流程，可以实现对特定基因的沉默，并进一步研究其对细胞功能的影响。
希望本文介绍的细胞siRNA转染操作流程能对相关研究工作者提供参考和指导。
siRNA转染 Protocol
siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。
以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。
siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。
这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。
o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。
o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于离心和分离细胞。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。
9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。
10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。
四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。
siRNA转染实验指导
siRNA转染RNA干扰现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的，广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的siRNA，随后siRNA与体内蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA 随即降解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因等相关基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。
本次实验采用罗氏的X-tremeGENE siRNA转染试剂进行实验。
一、细胞准备转染前一天，取出处于对数生长期的细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。
加入1ml胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入终止液终止消化。
收集细胞悬液于15ml离心管中，800r/min室温离心5min。
用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。
弃去上清，加入无抗生素培养基重悬细胞。
以1~4×105细胞/孔的密度接种到6孔培养板上，无抗生素培养基培养一天。
细胞转染前需用高质量血清进行培养，使细胞健康，否则将造成细胞营养不良，细胞呈现瘦削拉长状态，也会影响转染效率。
转染前3小时，取出无抗生素培养的细胞置于倒置显微镜下观察。
若融合率达50％～70％，即可进行转染实验。
二、耗材及试剂准备实验开始前将枪头、去核酸酶的EP管、试管架等放入无菌操作台，以紫外线照射30min。
转染前温育Optimen I Reduced Serum Medium，以及将X-tremeGENE siRNA转染试剂、siRNA 置于15-25度室温条件下平衡。
取出转染试剂，对EP管做好标记。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna转染原理。
siRNA（small interfering RNA）是一种短小的双链RNA，可以通过RNA干扰技术抑制靶基因的表达。
siRNA转染是一种常见的实验手段，用于研究基因功能和疾病治疗。
siRNA转染原理涉及到siRNA的合成、转染剂的选择和细胞内siRNA的靶向作用等多个方面。
下面将详细介绍siRNA转染的原理。
首先，siRNA的合成是siRNA转染的基础。
siRNA可以通过化学合成或者体外转录的方式获得。
化学合成的siRNA具有较高的纯度和稳定性，适合大规模生产和应用。
而体外转录的siRNA则可以根据实验需要进行定制，具有更高的灵活性。
无论是哪种方式获得的siRNA，在使用前都需要进行纯度和活性的检测，确保siRNA的质量符合要求。
其次，选择合适的转染剂对siRNA的转染效率和细胞毒性具有重要影响。
常用的转染剂包括脂质体转染剂和聚合物转染剂。
脂质体转染剂通过与siRNA形成复合物，促进siRNA进入细胞内。
而聚合物转染剂则通过电荷作用或者其他机制实现siRNA的转染。
在选择转染剂时，需要考虑到细胞类型、siRNA的特性以及实验的目的，以获得最佳的转染效果。
另外，siRNA转染的成功与否还与siRNA的靶向作用有关。
siRNA可以通过与RISC复合物结合，形成siRNA-RISC复合物，从而识别并降解靶基因的mRNA。
siRNA的靶向作用取决于siRNA序列的选择和siRNA-RISC复合物的稳定性。
因此，在设计siRNA时需要考虑到靶基因的序列和结构，以及siRNA与RISC复合物的结合能力。
最后，siRNA转染还需要考虑到细胞内信号转导通路的调控。
siRNA转染可能会影响到细胞内的信号转导通路，导致细胞功能的改变。
因此，在进行siRNA转染实验时，需要对siRNA的作用机制和细胞的响应进行全面的分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。
综上所述，siRNA转染原理涉及到siRNA的合成、转染剂的选择、siRNA的靶向作用以及细胞内信号转导通路的调控等多个方面。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna转染原理。
siRNA（small interfering RNA）是一种由约21-23个核苷酸组成的小分子RNA，能够通过RNA干扰途径特异性地抑制靶基因的表达。
siRNA转染技术已被广泛应用于基因沉默、基因功能研究以及潜在的治疗用途。
本文将介绍siRNA转染的原理及相关技术。
siRNA转染原理。
siRNA转染是通过将siRNA引入细胞内，使其与靶基因的mRNA结合，从而介导mRNA的降解，最终实现基因的沉默。
siRNA转染的原理主要包括siRNA的合成、转染剂的选择以及转染过程中的细胞内行为。
首先，siRNA需要经过化学合成或体外转录的方式进行制备。
合成的siRNA需要具有特定的序列，能够与靶基因的mRNA部分互补，形成双链RNA结构。
siRNA的设计需要考虑到靶基因的特异性和转染效率，通常选择靶向靶基因编码区域的siRNA序列。
其次，选择合适的转染剂也是siRNA转染的关键。
转染剂可以帮助siRNA穿过细胞膜，进入细胞内。
常用的转染剂包括脂质体、聚合物以及蛋白质等。
这些转染剂可以形成复合物，与siRNA结合后形成siRNA转染复合物，提高siRNA的稳定性和转染效率。
最后，在siRNA转染过程中，siRNA转染复合物需要与细胞表面的受体结合，进入细胞内。
随后，siRNA被释放出来，与靶基因的mRNA结合，启动RNA干扰途径，并介导mRNA的降解。
siRNA的引入和靶基因的沉默是一个动态的过程，需要考虑siRNA的稳定性和细胞内的代谢途径。
siRNA转染技术。
siRNA转染技术已经成为研究基因功能和潜在治疗的重要工具。
在基因功能研究中，研究者可以设计特异性的siRNA，沉默感兴趣的基因，观察其对细胞表型和生物学过程的影响。
在潜在治疗方面，siRNA转染技术可以用于治疗某些遗传性疾病和癌症等疾病。
总结。
siRNA转染技术是一种有效的基因沉默方法，可以用于基因功能研究和潜在的治疗用途。
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna转染技术是一种新型的基因治疗技术，它能够抑制特定基因的表达，以达到治疗某些疾病的目的。
Sirna转染是利用特殊的RNA分子通过特殊的方式来抑制特定基因表达的。
Sirna转染的原理具体为，在细胞内，可以通过特殊的载体蛋白（比如受体）将 Sirna送至细胞核， Sirna细胞核中会与目标基因的 mRNA合，合后的 Sirna/mRNA合体会被蛋白酶切割，致目标基因不能正常表达，以达到抑制目标基因表达的目的。
Sirna染技术在疾病治疗领域有着重大意义，其仅仅针对特定基因发挥抑制作用，不会影响到其他基因，有效降低治疗所带来的副作用，例如用于癌症治疗的 Sirna，可以有效抑制肿瘤基因的表达，从而减轻患者的症状，减少化疗毒性。
此外，Sirna染技术也可以用于病毒感染的治疗，通过 Sirna够有效抑制病毒致病基因的表达，从而阻断病毒感染。
Sirna染技术虽然在医学上具有许多优势，但是仍有一些问题没有被解决。
首先是 Sirna抗性，即 Sirna能会被细胞分泌的酶分解，从而导致转染的不稳定性；其次， Sirna染所涉及的分子机制也很复杂，需要研究人员充分理解才能正确开展转染操作；最后，Sirna 染目前仍属于新型技术，尚未进入临床应用阶段，仍需经历许多实验和临床试验，才能达到临床应用标准。
尽管 Sirna染技术存在着一些问题，但是通过科技的进步，克服这些问题的可能性是很大的。
随着科技的进一步发展，Sirna染技术可能会被用于更多的疾病治疗，有望成为一种重要的生物医学技术。
综上所述，Sirna染技术是一种新型的基因治疗技术，它能够抑制特定基因的表达，以达到治疗某些疾病的目的。
尽管 Sirna染技术仍存在一些问题，但随着科技的发展，它可能会成为一种重要的生物医学技术。
siRNA实验方法和设计常见问题解答
siRNA实验方法和设计常见问题解答转载请注明来自丁香园发布日期：2012-09-20 11:35 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：RNA miRNA 技术专题锐博生物丁香通丁香园点击次数：1080Q:如何选择转染方法和转染试剂？A:我们的siRNA适用于各种转染方法。
转染方法和转染试剂的选择，需要根据细胞来选择，对于容易转染的细胞，常用的转染方法是脂质体转染。
Q:对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？A:1)对于贴壁细胞，推荐采用转染试剂转染即可；2)对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。
一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。
转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。
具体可以参考我们的产品说明书。
Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关？A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法，而于siRNA的序列并没有直接关系。
因此，siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。
Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜？A:依不同的转染方法或转染试剂而定。
如使用lipofectamine 2000作为转染试剂，单独转染siRNA，30%～50%密度较佳；而siRNA与质粒共转染，密度可以到80%-90%。
Q:siRNA转染时的培养基要求，可否含血清？A:不同的转染试剂可能有不同的要求，对于lipofectamine 2000，在配制siRNA和lipofectamine 2000混合物时不能含有血清，但细胞培养基可以含有血清，但不能含有抗生素。
Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别？A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度，锐博推荐的贮存液浓度为20 μM；而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度，一般10～100 nM范围内，锐博生物推荐的转染浓度是50nM。
电穿孔法介导siRNA高效转染小鼠原代软骨细胞
Ｘ ｉ ａ ｎ ｈ ｕ ａ ，
Ｒ ｕ ｉ ， ｅ ｔ ａ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｂ ａ ｓ ｉ ｃ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｔ ｈ ｅ Ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ Ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ ２ ０ ０ ４ ３ ３ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
蛋白酶消化 ３ ｈ ， 然 后 应 用 高 效 电转 缓 冲液 和优 化 的 电转 参 数 转 染 ｐ Ｃ Ｍ Ｖ —Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ表 达 质 粒 或 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ， 用 台盼蓝检测细 胞存活率 ； 转染后 ４ ８ ｈ分 析 转染 效 率 和 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ靶 分 子 的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ和 蛋 白表 达 水 平 。结 果 电穿 孔 后 原 代 软 骨 细 胞 的存 活 率 ＞８ ０ ％， 质 粒 的转 染 效率达到 ３ ７ ． ３ ％ ± ５ ． ２ ％； ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ靶分子的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 和 蛋 白表 达 水 平 分 别 下 调 了 ７ ５ ％和 ６ ６ ％ 。结 论 导ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 转染 小 鼠 原代 软 骨 细 胞 的 方 法 ， 达 到 了很 好 的基 因沉 默 效 果 且 保 持 了 较 高 的 细 胞存 活 率 。
关 键 词 原 代 软 骨 细 胞 Ｒ Ｎ Ａ干 扰 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 电穿 孔
中 图 分 类 号 Ｒ ３ ４ 文 献 标 识 码 Ａ ＤＯＩ １ ０ ． １ １ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ － ５ ４ ８ Ｘ． ２ ０ １ ５ ． ０ ７ ． ０ ０ ７
成 功 建 立 ｈ ｌ ｙ Ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ Ｔｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ ｍａ ｌ ｌ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｒ Ｎ Ａ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｍｕ ｒ ｉ ｎ ｅ Ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ Ｃ ｈ ｏ ｎ ｄ ｒ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｖ ｉ ａ Ｏｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ｅ ｄ Ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ０ ｐ ０ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ． Ｌ ｉ ｕ Ａ ｎ ｊ ｕ ｎ， Ｍａ
siRNA转染实验指导
siRNA转染RNA干扰现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的，广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的siRNA，随后siRNA与体内蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA 随即降解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因等相关基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。
本次实验采用罗氏的X-tremeGENE siRNA转染试剂进行实验。
一、细胞准备转染前一天，取出处于对数生长期的细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。
加入1ml胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入终止液终止消化。
收集细胞悬液于15ml离心管中，800r/min室温离心5min。
用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。
弃去上清，加入无抗生素培养基重悬细胞。
以1~4×105细胞/孔的密度接种到6孔培养板上，无抗生素培养基培养一天。
细胞转染前需用高质量血清进行培养，使细胞健康，否则将造成细胞营养不良，细胞呈现瘦削拉长状态，也会影响转染效率。
转染前3小时，取出无抗生素培养的细胞置于倒置显微镜下观察。
若融合率达50％～70％，即可进行转染实验。
二、耗材及试剂准备实验开始前将枪头、去核酸酶的EP管、试管架等放入无菌操作台，以紫外线照射30min。
转染前温育Optimen I Reduced Serum Medium，以及将X-tremeGENE siRNA转染试剂、siRNA 置于15-25度室温条件下平衡。
取出转染试剂，对EP管做好标记。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA, siRNA表达载体或表达框架转染至真核细胞中的办法主要有以下几种： (1) 阳离子脂质体试剂在优化条件下，将阳离子脂质体试剂加入水中，可以形成极小的（大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上，以及带负电的细胞膜表面。
用法阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA一阳离子脂质体复合物。
被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。
(2) 磷酸钙共沉淀将氯化钙、RNA/DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含RNA 且微小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-RNA/DNA复合物黏附到细胞膜，并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的胜利至关重要。
在试验中用法的每种试剂都必需当心校准，保证质量，由于甚至偏离最优条件非常之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
(3）电穿孔法电穿孔通过将细胞裸露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜临时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于胜利的转染十分重要，由于过高的场强和过长的电脉冲时光会不行逆地损害细胞膜而裂解细胞。
普通胜利的电穿孔过程都陪同高水平（50％或更高）的毒性。
(4) DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。
通过用法DMSO或甘油获得的渗透休克，将DNA复合体导人细胞。
两种试剂都已胜利用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
(5）机械法转染技术也包括用法机械的办法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle)。
显微注射用法一根细针头将DNA, RNA或蛋白质挺直转入细胞质或细胞核。
基因枪用法高压microprojectile将大分子导入细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。
除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。
如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：
一、对siRNA有较高的转染效率。
转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。
金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来，发挥抑制基因表达的作用。
通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。
因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。
目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。
就转染效率而言，RFect与RNAiMAX对绝大多数贴壁细胞的基因抑制效率都比较高，RFect在A549细胞中对LaminA/C的基因抑制效率可达95%，RNAiMAX在A549细胞中对LaminA/C的基因抑制效率也能到90%，与之相比，Lipo2000的抑制效率只有70%左右。
显然，从转染效率上说，RFect与
RNAiMAX更具优势。
二、对待转染细胞的毒性很小。
转染试剂如果毒性过大，会导致大量细胞死亡，这会直接影响对转染试验结果的判读和解析。
脂质体类转染试剂本身会导致某些基因的表达改变，因而会影响转染试验结果的客观性。
以上可见，应尽量选择毒性小的转染试剂。
有些研究者对细胞毒性不太重视，仅仅考虑是否可将siRNA转染进入细胞，其结果在某些高水平的期刊，往往会导致审评的质疑。
对于国内常见的几种转染试剂来说，RFect转染试剂主要由生物纳米材料制成，细胞毒性最低，细胞死亡率不到5%。
RNAiMAX与Lipo2000属于脂质体类转染试剂，具有脂质体固有的细胞毒性，其中RNAiMAX的细胞死亡率在15%左右，Lipo2000的毒性较大，细胞死亡率在30%左右。
三、转染细胞的种类。
目前常见的转染试剂包括RFect、Lipo2000、RNAiMAX 及国内其它厂家的产品，主要转染对象为贴壁培养细胞，对悬浮细胞和原代细胞的转染效率都不是非常理想。
Lipo2000对原代和悬浮细胞基本上无法做到有效转染，而且因为原代细胞较驯化的细胞株敏感性更高，Lipo2000转染后的死亡率也很高。
RNAiMAX在部分原代细胞中的转染效率可达60%，但细胞毒性也比较明显，我们实验室曾用之转染过血管内皮细胞，发现细胞成片死亡，导致实验无法继续。
RFect 转染试剂细胞毒性较低，但转染原代细胞和悬浮细胞的效果也不是非常理想，需要选择该系列专门的原代细胞和悬浮细胞转染试剂。
另外，RFect转染试剂存在有比较明显的缺点，不能用于质粒DNA的细胞转染，如果既要转染siRNA,还要转染质粒DNA，需要另外选购质粒DNA转染试剂。