柚苷酶活力测定方法的研究
透明圈法筛选柚苷酶高产菌株
Ｏ 前言
柑 桔类 水果 是世 界上 最 主要 的亚热 带水果 之
一
广 泛应 用 ， 主要原 因是 柚 苷 酶 工 业 化 生 产 中 尚 其
缺乏适合的高产酶菌株 ， 因此高产菌株的筛选是 当务之 急 。开 展新 的筛 选方 法 、 型研 究工 Ｊ 模 作， 高效地从成千上万 的诱变后代 中选 出优秀突 变株十分重要 。本文依据柚苷酶酶活测定原理 ， 利 用 Ｄ Ｓ在 碱 性 条 件 下 与培 养 基 中未 分 解 的底 Ｅ
物 柚皮 苷发 生黄 色 显 色 反 应 ， 究 设 计 出一种 较 研
，
在 我 国柑 桔资 源 丰 富 ， 产量 巨大 ， 其果 实 中含
多种 营养 成 份 ， 丰 富 的葡 萄糖 、 有 果糖 等 ， 含 有 还
一
定 量 的硫 胺 素 、 黄 素 、 核 生物 类 黄酮 、 胡 罗 卜 类
素等生 理 活性物 质 。因此 开展柑 桔加 工 和综合 利
用很有必要 。柑桔加 工过程 中会出现 明显苦 Ｊ 味， 其中柚皮苷是苦味 的主要成分 。由于柚苷酶
能分 解 柚 皮 苷 得 柚 配 质 （ ａｉｇｎ ） 葡 萄 糖 和 Ｎ ｒ ｅｉ 、 ｎ ｎ
高层试管法更易观察的柚苷酶生产菌初筛方法。
维普资讯
第２卷 第１ ５ 期
２０ ０ ７年 ２月
江
西
科
学
Ｖｏ ． ５ Ｎｏ １ ２ ．１ Ｆｅ ２ ７ ｂ． ００
ＪＡＮＧ Ｓ Ｉ ＮＣ Ｉ ＸＩ ＣＥ Ｅ
文 章 编 号 ：０ １ ６ ９ ２ ０ ） １— ０ ７一ｏ １０ —３７ （ ０ ７ ０ ０ ２ ３
蜜柚多酚氧化酶的酶学特性与活性测定研究
１ 材 料 与 方 法
１１ 试 验材 料 ．
分别加入不 同 ｐ 的磷酸缓 冲液 ４ｍＬ 立 即在 ４０ｎ Ｈ ， ２ ｍ 下测定吸光度值 。以不 同 ｐ 但不加酶提取液的反应液 Ｈ
第 一作者 简介 ： 纪淑娟 （ ９ ｏ） 女 ， 士 ， １ ６一 ， 博 教授 ， 主 要从 事食 品质 现 量控 制教 学和 研 究工作 。
８ ￣ ９ ℃水浴 中分别保 温 ５ １ 、０ｍ ｎ 将反应 液迅速 ０ Ｃ、０ 、０ ２ ｉ， 冷却至室温 ， 加入酶提取 液 １ｍＩ 参照 １２ ２的方法测 ， ．． 定残余酶的吸光度值变化 。
取液 。
１２ ２ Ｐ Ｏ 活性 测 定 ．． Ｐ
采 用 比色法 测 定 。将 １ｍ ０ １ Ｉ ． （
主要是多酚氧化酶 （ Ｐ 引起 的［。 Ｐ Ｏ） ３］ 。 。多 酚氧化 酶是一 类含 Ｃ 元素 的膜结 合蛋 白， ｕ 它催化 果蔬体 内的多酚类 物质氧化形 成醌 ， 者 自身缩 合 或 与细 胞 内蛋 白质 结 后
合 ， 成褐 色 或 黑 色 物质 。多 酚 氧 化 酶 活 性 测 定 已成 为 形
ｍ ｌＬ ￣ 苯 二 酚加 入 ４ｍＩ磷 酸缓 冲 液 （Ｈ ６４ 中 ， ｏ／ ）ｇ ｐ ． ） 加 入 １ｍ 液 ， 即 于 波 长 ４ ０ｎ 下 测 定 吸 光 度 的 变 Ｉ酶 立 ２ ｍ
化， 每隔 ２ 记录 １ ， ０Ｓ 次 共记录 ３ｍｉ。以不加酶提取液 ｎ 的反应 液 做 对 照， 以每 分 钟 吸 光度 变 化 ０ ０ ． １为 １个 Ｐ Ｏ 酶活性 单位 。 Ｐ
柚苷酶的应用及发酵生产研究
１０ ０ ｍＬ左 右 ； 柚苷 酶加量 以 １ ／ ５ｕｍＬ为宜 ； 酒精度为 ６ ８％～ ８ ０％（ 时 ， Ｖ） 有利于醋酸发酵 ， 制得 的果醋清亮透 明 ， 酸甜可 口 ， 香明显 ， 果 基本无苦 味 。励建荣 等［］ ８以黄 岩蜜 桔为 原料
我 国 柑 桔 资 源 丰 富 ， 展 柑 桔 加 工 和 综 合 利 用 很 有 必 开
柚苷酶可 以应用 于柑桔 汁脱苦 。汪钊 等＿ 发现 加酶量 ４ Ｊ １ ／ ０ ｐ ６ｕ １０ｐ ｍ柚皮 苷 ，Ｈ ． ～４ ６ ５ ｐ ３ ６ ． ，０℃作 用 ２ ， ～３ｈ 无核 桔 汁苦味基本 消失 。王鸿飞 等＿ 采 用正 交试验 进行柚 皮苷 ５ ｊ 酶对 胡柚汁脱苦工 艺条件 的优化 ， 出其最适 工 艺条件 为 ： 得
指出柚苷 梅生 产中存在 的问题及对策 。
关键词 ：柚苷酶 ； 应用； 发酵； 进展
Ｓ ｕ ｙ ｏ ｔ ｐｌｃ ｔｏ ａ ｒ ｅ ａ ｉ ｎ ｏ ｒ ｎｇ ｎ ｓ ｔ ｄ ｎ ｈｅ Ａｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｎｄ Ｆｅ ｍ ｎｔ ｔｏ ｆ Ｎａ ｉ ｉ ａ ｅ
Ｚ ４ＮＧ Ｈ ．ＬＩ Ｕ Ｚｈｉｕ —
合 物 的柚 皮苷 水解 成 鼠李糖 和普 鲁 宁 ， 鲁 宁 的苦 味 约 为 柚 普
柚苷酶还 可 以应 用 于其 它 柑桔 制 品 生产 过程 的脱苦 。
何晋浙等 ｒ 证实柚苷酶在柑桔果醋制备 的生产工艺 中， 能有
效地除去柑 桔醋 中的柚皮 苷 苦味 物质 ， 最 适 的工 艺条 件 其
果汁进行 了脱 苦性 实验 ， 发现 ４ ０℃时其最适 的加 酶量为 ２ ． ８ ２ ｍＬ， ４Ｕ／ 最适 ｐ Ｈ值 为 ３ ５ ． ， 少作 时间 ６ ｎ 脱 ． ～４ ５ 最 ０ｍｉ，
微生物柚苷酶的研究进展
微生物柚苷酶的研究进展
宋金鹏;仲秀芳;胡晓晴;田淑斌;范光森
【期刊名称】《河南工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2024(45)2
【摘要】柚苷酶是一种具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶学活性的酶,在柑橘类产品脱苦、鼠李糖和普鲁宁制备及类固醇的生物转化等方面具有广泛的应用前景。
柚苷酶来源广泛,其主要来源为微生物。
不同来源柚苷酶的酶学性质往往会存在差异,从而影响其应用领域。
系统地从柚苷酶来源、微生物产酶、活力测定、分离纯化与性质、克隆表达、结构、固定化及应用等方面对柚苷酶进行了综述,有助于指导其更好地科学研究和工业化应用。
【总页数】12页(P19-30)
【作者】宋金鹏;仲秀芳;胡晓晴;田淑斌;范光森
【作者单位】德州市纤维检验所;北京工商大学食品与健康学院;淄博新糖源营养健康研究院;北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2
【相关文献】
1.柚苷酶产生菌的选育及其酶特性研究进展
2.柚(皮)苷酶的研究进展
3.柚苷酶的生产及其在食品工业中的研究进展
4.微生物来源柚苷酶的研究进展及应用
5.产柚苷酶菌株改良、性质及其在柑橘酒中的应用研究进展
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柚皮苷酶对柑橘类果汁脱苦效果的研究
根据柚皮苷酶作用的特性, 分别研究酶剂量对脱苦 效果的影响 (在果汁温度为 45℃、果汁 pH 3. 5、作用时 间 60 m in 的条件下) ; 果汁的 pH 值对脱苦效果的影响 (在酶量为 0. 5 g·L - 1、果汁温度为 45℃、作用时间 60 m in 的条件下) ; 果汁温度对脱苦效果的影响 (在酶量为
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176
农业工程学报
2004 年
影响果汁本身的质量, 就必须在较短的时间内完成酶处 理脱苦的任务。
图 3 果汁的 pH 值与脱苦率的关系 F ig. 3 R elation sh ip betw een ju ice pH value and deb ittering rate
图 1 标准曲线图 F ig. 1 Standa rd cu rve
图 2 柚皮苷酶用量与脱苦率的关系 F ig. 2 R ela tion sh ip betw een na ring ina se u sage
am oun t and deb ittering ra te
③样液测定: 准确吸取待测液 3 mL 2 份, 于 2 支具 塞试管中, 加试剂空白液至 5. 0 mL , 各加 90% 二甘醇 5. 0 mL , 再分别加 4 m o l·L - 1 N aO H 0. 0 和 0. 1 mL , 摇匀, 以标准曲线同样的方法进行发色、测定, 以加碱管 的吸光度减去不加碱管中的吸光值, 查标准曲线, 即得 所取样液中柚皮苷含量毫克数。
柚苷酶生产菌TC-01发酵培养条件的优化及其酶学性质的初步研究
素试验优化碳 、氮源对产酶的影响 ，利用 Ｐａｋｔ Ｂ ｒ ａ ｌｃｅ— ｕｍ ｎ设计筛选影响产酶的主要 因素 ，最 后通 过响应面分析法对 ｔ 液体发酵培养条件进行优化 ，优化后柚苷酶酶活 与初始相 比提高了 ２４倍 ，达到 １２ ６ ／ Ｌ － １． Ｕｍ 。对 Ｔ 一 １ ７ ｃ ０ 产柚苷酶 中 Ｏ一鼠李糖苷酶和 １一 ｔ ３ Ｄ葡萄糖苷酶 的酶学性质分别进行 了研究 ，２ 酶反应 的最适反应温度均为 ６ 个 ０℃，在 ５ ０℃以 下保温 １ｈ ，２个酶的活力基 本不受损失 ；２个酶最适 ｐ Ｈ值为 ４０ 一鼠李糖苷酶在 ｐ ．， Ｈ值 ４０ ８ ．— ． ０范围内稳定性较
柚苷酶生产 菌 Ｔ 一 １发酵培养条件 的优化 Ｃ ０ 及 其酶学性质 的初步研 究
邓 媛 ， 毛 勇，张 美丽 ，王 燕，李 飞 ，李 皎
（ 陕西省微生物研究所 ，陕西 西安 ７ ０ ４ ） １０ ３
摘 要 ：以黑 曲霉 Ｔ 一 １ Ｃ ０ 菌株 作 为 试 验 材 料 对 其 液 态 发 酵 条 件 及 初 步 纯 化后 的柚 苷 酶 的 酶 学性 质进 行 研 究 。采 用 单 因
Ａｂ ｔ ｃ ： Ｉ ｉ ａｔ ｌ ， ｔ ｅ ｇｌ ｓ ｒＴ Ｏ１ ｗ ｉ ｈ ｉ ｃｅ ｎ ｄ ａ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｍａ ｅ ｉｌ ， ｌ ｕｄ ｅ ｐ ｒ ｎａ ｐｉ ｓ ａ ｔ ｎ ｔ ｓ ｒ ｃｅ ｏＡｓ ｒ ｉ ｕ ．ｎ ｒ ｈ ｉ ｐ ｌ Ｃ－ ｈ ｃ ｓｓ ｒ ｅ ｅ ｓ ｅ ｐ ｒ ｎ Ｍ ｔ ｒ ｓ ｉ ｉ ｘ ｅ ｉ ｉ ａ ｑ ｍｅ ｔｌｏ ｔ －
Ａｓ ｒ ｉｌｓ ｒＴＣ－ ｐｅｇ ｌｕ ．ｎ Ｏ１
ＤＥ ＮＧ ｕ ｎ， ＭＡＯ Ｙｏ ｇ Ｚ Ｙ ａ ｎ ， ＨＡＮＧ ｉｌ， Ｗ ＡＮＧ Ｙａ Ｍｅ—ｉ ｎ，Ｌ ｅ， Ｌ ｉｏ ＩＦ ｉ Ｉ ａ Ｊ
柚子全果综合利用及生物活性研究进展
化效 果主要是通过消除 过氧 化物 、清 除羟 自由基 、抗 脂质过 氧
化活性来实现 。戴玉锦 等 制备 了富含黄酮 的柚皮 提取物 ，并 研究 了其抗氧化性 和对 大肠 杆菌及 黑曲霉 的抑菌作 用 ，表 明较 低浓度抗氧化作用 ，较高浓度 轻微助 氧化作 用 ，同时 对大肠 杆
菌具 有明显的抑制作用 ，甚 至比 ７ ０ ％乙醇抑菌作 用更强 ，但 对 纤维 中可溶性膳食纤维 的提取率 。贾冬英 也研究 了柚皮 中不 黑曲霉无 明显抑制作用 。赵 雪梅等 研究胡柚提取 物对 淋 巴细 溶性膳食纤维 （ Ｉ Ｄ Ｆ ） 的持水 力和膨胀 力及 对胆 固醇 的吸 附性 的 胞 的增殖试验发现胡柚 提取物 对 Ｔ 、Ｂ淋 巴细胞 的增殖 反应 均
ｖ ｉ ｔ ａ ｍｉ ｎｓ ，ｍｉ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ ｓ，ａ ｎｄ ｉ ｎ ｓ ｕ ｌ ｉ ｎ ｃ ｏ ｍｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ，ｂ ｕ ｔ ａ ｌ ｓ ｏ ｈａ ｓ ｉ ｍｐｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ｂｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ． Ｇｒ ａ ｐ ｅ ｆ ｒ ｕ ｉ ｔ ｐ ｅ ｅ ｌ ａ ｃ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｓ ｆ ｏ ｒ
３ 柚 子皮提取物生理功效
３ ． １ 柚 皮苷 的抗 氧 化 、抗癌 、 降胆 固醇活 性
柚 皮 苷 是 一 种 存 在 于 西 柚 果 皮 中 的 多 酚 ，有 抗 氧 化 、分 解 血管脂肪酸 、提高免疫力 和抑 制食欲等 的作 用。柚皮 苷的抗 氧
１ ． ３ 膳 食 纤维
膳食纤维 （ Ｄ ｉ ｅ ｔ ａ ｒ ｙ Ｆ ｉ ｂ ｅ ｒ ） 按其 在水 中的溶 解性 可分 为 水溶
１ 柚 子 皮 综 合 利 用 现 状
１ ． １ 天然 色素
柚苷酶应用下食品工业
柚苷酶应用下食品工业1。
1Davis紫外分光光度计法如今多采纳改进后的Davis测酶活方法，该种方法也是测定酶活应用最多的一种。
但缺点是后期紫外分光光度计时会受究竟物颜色的限制，柚皮苷为黄色溶液，可能影响柚皮苷含量的测定，进而使测定的酶活不精确，并且仅是对底物柚皮苷的含量测定来获得柚苷酶的酶活力大小，无法知道组成该酶的其他酶α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶的酶活力状况。
1。
2高效液相色谱仪测定柚皮苷含量用高效液相色谱来测定柚苷酶水解的底物柚皮苷的含量，不仅可以测定柚苷酶的酶活力，同时还可以测得α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶的酶活力大小，使酶活测定精确详细化，检测柚皮苷的精确度高，误差小，提高了结果的精确性，但是操作较前一种Davis法繁琐，时间延长。
对于不同的柚苷酶，高效液相色谱法检测分析的试验条件不同。
陈月龙在其论文中采纳高效液相色谱测定酶活时的流淌相选取的是甲醇、水、乙腈并采纳不同梯度洗脱分别柚苷酶水解后的产物，从其结果中可看出实现了柚皮苷、柚皮素与普鲁宁的完全分别。
邓媛等也采纳高效液相色谱对柚苷酶活力以及普鲁宁酶活力进行测定，同时进行了酶促动力学讨论，得出柚苷酶酶解的最正确条件。
高效液相色谱法测定柚皮苷含量的优点是直接反映酶解作用的各种产物含量，可获得该酶所包含的各种酶的酶活力大小，方法精确直观，直接测得不同酶活力大小，缺点是操作较冗杂。
2微生物来源柚苷酶的制备2。
1柚苷酶产生菌株的筛选有效的微生物筛选方法可以大量节省菌株筛选的时间和本钱，因此在筛选柚苷酶产生微生物的过程中选择合适的筛选方法至关重要。
目前微生物的筛选方法有透亮圈法、高层试管法以及定性滤纸显色法，其中高层试管法和定性滤纸法误差较大，相较而言，透亮圈法操作简洁，观看便利，适用于定性筛选，是目前应用较为广泛的一种筛选微生物方法。
2。
1。
1透亮圈法透亮圈法是指微生物分解平板培育基中溶解性较差的底物，使菌落四周产生透亮圈，圈的大小初步反应当菌株利用底物的力量。
柚皮苷药物动力学及生物活性研究新进展
华夏医学
Ａｃｔａ
Ｖ－０１．２２ Ｎｏ．４ Ａｕｇ．２００９
Ｍｅｄｉｃｉｎａｅ
Ｓｉｎｉｃａ
柚皮苷药物动力学及生物活性研究新进展①
黄凤香，林家逊
（桂林医学院药学院，广西桂林５４１００４）
关键词：柚皮苷；药物动力学；生物活性 中图分类号：Ｒ９６９．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８．２４０９（２００９）０４—０７７７—０３
１柚皮苷药物动力学研究进展
药物在体内的作用与其药物动力学特征密切相 关。有学者报道［１］测定葡柚汁中柚皮苷等３种黄酮类 成分口服给药７０ｍｇ后在Ｂｅａｇｌｅｓ犬中的药物动力学 参数，其中柚皮苷的ＡＵＣ为２３．１６ｍｉｎ・ｍｍｏｌ－１・ Ｌ～，平均滞留时间为３．３（１．５一－．９．３）ｈ。 另外，有报道［２］采用双盲法研究柚皮苷与咖啡因 联合使用时，咖啡因药动学的改变，发现单纯的加入 柚皮苷对咖啡因并没有什么影响，而与葡柚汁联合使 用却有一定的改变。日本学者［３＾］分别采用血药浓度 法和尿药浓度法，利用ＨＰＬＣ对人血中和尿中的柚皮 苷含量进行测定，采用加入内标物的方法进行测定， 通过验证实验证明该方法可行。 虽然有学者对柚皮苷的体内药物动力学作了一 定的研究，但是均不深入，有的研究主要是观察柚皮 苷对别的药物的药动学的影响，对柚皮苷本身在体内 的代谢规律等内容均未见文献报道，因此，有待更进 一步的探究。
韩国，１９９９，（１）：２５—２７．
［６］ＨＹＵＮ—ＪＵ
ｅｔ
ＳＥＯ，ＫＹＵ—ＳＨＩＫ
ＪＥＯＮＧ，ＭＩ—ＫＹＵＮＧＬＥＥ，
ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｌ
ｎａｒｉｎｇｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｌｉｐｉｄ
ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ７３：９３３—９４６．
蜜柚多酚氧化酶的酶学特性与活性测定研究
［ ］ １２ 并直接 褐变是果蔬采后重要的生理变化现象 － ， 影响着果蔬贮藏的品质和商品价值。 果蔬采后的褐变 ］ ３ ５ － 。 多酚氧化酶是一 主要是多酚氧化酶 （ 引起的［ Ｐ Ｐ Ｏ）
取液。 （ １ ． ２ ． ２ Ｐ Ｏ 活性测定 采用比色法测定。将１ｍ Ｌ ０ ． １ Ｐ ／ ） ） 邻苯二酚加入 ４ｍ 中， 加 Ｌ Ｌ 磷酸缓冲液 （ ６ ． ４ ｍ ｏ ｌ Ｈ ｐ 入１ｍ 立即于波长 ４ Ｌ 酶液， ２ ０ｎ ｍ 下测定吸光度的变 。以不加酶提取液 化， 每隔２ 共记录３ｍ ０ｓ记录１次， ｉ ｎ 的反应 液 做 对 照， 以每分钟吸光度变化０ ． ０ １为１个 Ｐ Ｐ Ｏ 酶活性单位。 下 １ ． ２ ． ３ Ｐ Ｏ 活性的影响 在室温（ １ ８ ℃） 底物浓度对 Ｐ （ 将ｐ 的磷酸缓冲液 加入 邻苯二酚 浓 ６ ． ４ ４ｍ Ｌ １ｍ Ｌ Ｈ 、 、 、 、 中， 按１ 度分别为０ ． ０ １ ０ ． ０ ２ ０ ． ０ ４ ０ ． ０ ８ ０ ． １ Ｍ） ． ２ ． ２的 方法测定不同底物浓度下的 Ｐ Ｐ Ｏ 活性。 Ｈ 配制不同 ｐ Ｈ 的磷酸氢二钠 － １ ． ２ ． ４ Ｐ Ｏ 最适 ｐ Ｐ 、 磷酸二氢钠缓冲液， 取酶液１ｍ Ｌ０ ． １Ｍ 邻苯二酚 １ｍ Ｌ ， 分别加入不同 ｐ 立即在 ４ Ｈ 的磷酸缓冲液 ４ｍ Ｌ ２ ０ｎ ｍ 下测定吸光度值。以不同ｐ Ｈ 但不加酶提取液的反应液 ， 。 做对照 测定方法同上 １ ． ２ ． ５ Ｐ Ｏ 最适反应温度和对温度的稳定性 参照段 Ｐ ［ ］ １ ０ 、 将０ 玉权等 的方法， ． １ Ｍ 的邻苯二酚 １ｍ Ｌ Ｈ ６ ． ４ ｐ ， 的磷酸缓冲液４ｍ Ｌ 和酶提取液１ｍ Ｌ 混合 在不同温度 水浴（ 间隔为１ 中分别保温１ 加三 ０ ９ ０ ℃， ０ ℃） ０ｍ ｉ ｎ后 ， ～ 氯乙酸终止反应， 反应液冷却至室温， 在４ ２ ０ｎ ｍ 处测定 吸光度值。对温度的稳定性测定是将 ０ ． １ Ｍ 的邻苯二 、 酚１ｍ Ｌｐ Ｈ ６ ． ４的磷酸缓冲液４ｍ Ｌ 混合液分别在 、 、 ， 将反应液迅速 ８ ０ ℃、 ９ ０ ℃水浴中分别保温 ５ １ ０ ２ ０ｍ ｉ ｎ ， 冷却至室温， 加入酶提取液 １ｍ 参照 １ Ｌ ． ２ ． ２ 的方法测 定残余酶的吸光度值变化。 １ ． ２ ． ６ Ｐ Ｏ 浓度下的平均酶活性的测定 在室温 不同 Ｐ （ 、 １ ８ ℃） Ｈ ６ ． ４ 条件下测定不同酶液浓度时产物吸光度 ｐ 、 、 、 、 随时间的变化。分别在４ ． ９ ４ ． ８ ４ ． ６ ４ ． ４ ４ ． ２和４ ． ０ｍ Ｌ ） 磷酸缓冲液（ 中加入 １ｍ ６ ． ４ Ｌ ０ ． １ Ｍ 的邻苯二酚， Ｈ ｐ １ ７ １
柚苷皮苷含量测定方法的研究进展
柚苷皮苷含量测定方法的研究进展摘要】目的综述柚苷皮苷含量测定的方法。
方法对近年来的用于柚皮苷提取，分离纯化，含量测定的一些方法进行汇总，并分析。
结果用于柚皮苷提取，分离及纯化，含量测定的方法有多种，各有优缺点。
结论近年来用于柚皮苷提取最常用的为溶剂提取法，分离纯化常用的吸附剂为聚酰胺和硅胶，含量测定常用高效液相色谱法。
【关键词】柚皮苷含量测定研究进展柚是芸香科柑桔属水果，不仅具有较高的营养价值，而且具有极高的药用价值。
柚皮苷全称为柚皮素-7-0-新橙皮糖苷，是一种双氢黄酮类化合物，其结构是在黄酮基本结构的第七位置上以糖苷键的形式接一个葡萄糖和鼠李糖，由一分子的芸香糖与柚皮素(naringenin)成苷，由于A环和B环之间完全没有共轭，所以在282nm有强烈的紫外吸收峰。
纯柚皮苷是一种白色粉末状固体，在水中的溶解度很小，常温下的溶解度约0.1％，溶于丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、热的醋酸和水，不溶于乙醚、己烷和氯仿等，熔点为83℃。
1 柚皮苷的提取柚皮苷大部分存在于柑橘加工的废弃物中，如果皮、果囊，其中成熟的果皮和组织中柚皮苷的含量最高。
柚皮苷的提取方法根据柚皮苷的结构及性质有：（1）碱提酸沉法：用饱和Ca(OH)2溶液浸提，用HCL溶液沉淀的方法提取柚皮苷。
（2）溶剂提取法:由于柚皮苷溶于甲醇，乙醇，丙酮，正丁醇及水等溶剂中，故可用甲醇、乙醇或者水浸泡一定时间提取柚皮苷。
2 柚皮苷的分离及纯化方法柚皮苷的分离及纯化基本上是将提取液过滤,浓缩或挥干加溶剂适量上柱，进行柱分离，有机溶剂洗脱；洗脱液挥干溶剂，得粗品；再经多次重结晶，得柚皮苷晶体；或直接收集洗脱液进行含量测定。
所使用的分离物质有多种,如大孔树脂,聚酰胺,硅胶等,但因其吸附原理不同,同时相同的吸附剂不同型号及其吸附效能也有所不同,故选择吸附剂时要根据柚皮苷的性质及实验条件选择分离效果最佳的吸附剂。
3 柚皮苷的含量测定柚皮苷的含量测定也有多种方法，包括紫外分光光度法[1]，薄层扫描法，胶束电动毛细管电泳法，流动注射双安培法，反相高效液相色谱法，高效液相色谱法等，其中近年来柚皮苷含量测定中最常用的为高效液相色谱法。
产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究的开题报告
产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究的开题报告一、研究背景与意义柚叶素是一种来自柚子中的苄基化的二苯基丙烷类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、减肥、降血糖等多种药理活性。
其主要形式为柚叶素苷（naringin），是一种黄酮丙糖苷，可在体内通过酯酶水解为柚叶素。
因此，柚叶素苷是柚子中的生物前体，具有重要的发展前景。
目前，柚叶素主要从柚子中提取分离，但其收率较低且分离过程较复杂。
利用微生物发酵生产柚叶素苷是一种新的生产方式，具有生产成本低、规模化生产能力强等优点，因此备受关注。
柚叶素苷在体内通过酯酶水解为柚叶素，因此酶解柚叶素苷的酶——柚苷酶是柚叶素苷生产的关键酶。
因此，如何高效地筛选和鉴定柚苷酶高产菌株，以及对该酶的产酶特性进行研究，对柚叶素苷的生产具有重要的意义。
二、研究目的本研究旨在通过筛选、鉴定和产酶特性研究，寻找高柚苷酶产生的菌株，并对该酶的产酶特性进行探究，为柚叶素苷生产提供基础研究支持。
三、研究内容与方法1. 筛选高产柚苷酶菌株。
从自然界和土壤样品中，通过培养基筛选出菌株，利用酶促法快速鉴定柚苷酶高产菌株。
2. 鉴定柚苷酶高产菌株。
对筛选出的柚苷酶高产菌株进行16S rDNA序列分析，确定其属于的种或亚种。
3. 产酶特性研究。
利用该菌株发酵生产柚苷酶，并对该酶的反应条件、酶促性质、稳定性等多个产酶特性进行研究。
四、研究预期成果本研究预期可筛选出柚苷酶高产菌株，并对该菌株的产酶特性进行研究，从而为柚叶素苷的生产提供基础研究支持。
五、研究进度安排序号 | 内容 | 时间安排1 | 背景及意义分析、目的确定 | 前期阶段2 | 菌株筛选及鉴定 | 第1-3个月3 | 柚苷酶产酶特性研究 | 第4-10个月4 | 结果分析、论文撰写 | 第11-12个月六、研究经费预算分配经费来源 | 经费预算通用经费 | 10万元设备费 | 5万元材料费 | 5万元人员费 | 20万元合计 | 40万元。
柚皮苷生物活性和药代动力学研究新进展
『 药物研究』
比 。 柚 皮 苷 的 抗 氧 化 活 性 ，与 其 分 子 结 构 内 的 酚 羟
基 密切 相 关 。
１２ 降血 脂 ．
体 内研 究 表 明 ，柚 皮 苷 具 有 降 低 胆 固 醇 的 作 用 。
柚 皮 苷 降血 胆 固醇 作 用 可 能 通 过 抑 制体 内 参 与 胆 固醇 合 成 酶 的 活 性 （ ＨＭＧ—Ｃｏ Ｄ 如 Ａ￣ ＡＣＡＴ），减 少 胆 固 醇 在 体 内 的合 成 ，促 进 胆 固醇 的 分 解 ，减 少体 内低 密 度 脂 蛋 白 （ ＤＬ）等途 径 实 现 的。 Ｌ
性氧 分 子 、作 为 供 氢体 与 自由基 结合 消 除 自由基 或 形 成 稳 定 的化 合 物 ，也 可 与 某 些过 渡金 属 离子 络 合 而 终
【 ｅ ｏ ｓ Ｎａｎｉ；ｂ ｌ ｃ ｔｉ ； ｈｍ ａ ｋ ｅｃ Ｋｙ ｒ 】 ｗ ｄ ｒｇ ｉ ｎ ｉｏ ａ ｃｖｙ ｐａ ａ ｏｉ ｔ ｏ Ｎ ｌ ｉｔ ａ ｃ ｎｉ
柚 皮 苷 全 称 为 柚 皮 素 一 一。一新 橙 皮 糖 苷 ，是 一 ７ 种 双 氢 黄 酮 类 化 合 物 ， 主 要 存 在 于 芸 香 科 植 物 葡 萄
ｎ ｏ ａ ｉｎ ＆ Ｍ ａ ａ ｅ ｅ ｔ ｎ ｖ ｔ ｏ ｎ学
柚 苷 物 性 皮 生 活 Ｏ
・ 文／ 玲 苏 刘 启 德
Ｂｉｌ ｉａｌ ｃ ｉｉ ｄ ｐ ａｒ ａ ｏｋｎ ｔｃ ｏｏｇｃ ｔ ｔ ａｎ ｈ ｍ ｃ ｉｅ ｉｓｏｆ ａ ｖｙ Ｎａｒ ｇｉ ｉ ｎ ｎ
粥 样硬 化 、解 痉 、镇 痛 、调 节血 糖 等 方 面 具 有 较 强 的 生 物 活 性 。近 年 来 ，国 内 外 学者 对 柚 皮 苷 生 物 活 性 及
黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究
黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究王维娜1，李佥1，田晶1，费旭2，徐龙权2，廉萌1(1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)(2.大连工业大学现代教育技术部，辽宁大连 116034)摘要：本文针对黑曲霉液态发酵所产柚苷酶的分离纯化工艺及其酶学性质进行研究。
将黑曲霉液态发酵所产酶液，依次通过30%~70%硫酸铵盐析、膜透析和DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析后得到高纯度柚苷酶。
经SDS-PAGE 凝胶电泳仅得到一条清晰条带，分子量约为65.10 ku 。
纯化获得的柚苷酶比酶活可达6932.54 U/mg ，纯化倍数和酶活回收率分别为13.82倍和13.30%，并且能有效水解柚皮苷。
进一步研究发现，该酶的最适反应pH 为4.5，最适作用温度为50 ℃，在20 ~50 ℃℃及pH 3.0~6.0范围内有良好的稳定性。
在一定浓度范围内，K +、Ca 2+和Na +对柚苷酶活性有促进作用，而Fe 3+、SDS 和EDTA-Na 2对其活性有明显的抑制作用。
本研究为深入理解柚苷酶分离纯化过程，明确其酶学性质，进一步探索柚苷酶应用于天然活性产物生物转化过程的相关机制提供了基础数据，具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。
关键词：黑曲霉；液态发酵；柚苷酶；纯化；酶学性质文章篇号：1673-9078(2016)07-72-78 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.7.012Isolation, Purification, and Properties of Naringinase Produced fromAspergillus niger FFCC 848 by Liquid FermentationW ANG Wei-na 1, LI Qian 1, TIAN Jing 1, FEI Xu 2, XU Long-quan 2, LIAN Meng 1(1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China) (2.Modern Education Technical Department, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)Abstract: The isolation, purification, and enzymatic properties of naringinase produced by liquid fermentation with Aspergillus niger FFCC 848 were investigated. The fermentation broth produced from liquid fermentation by A. niger FFCC 848 was purified by ammonium sulfate fractional precipitation, dialysis, and DEAE-Sepharose FF anion exchange chromatography to yield highly purified naringinase. Only one clear band was observed upon sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, with a molecular weight of 65.10 ku. The final, purified naringinase showed 13.82-fold purification, with an enzyme activity recovery of 13.30% and specific activity of 6932.54 U/mg, and the enzyme could effectively hydrolyze naringin. Furthermore, the activity of naringinase was stable at 20–50°C and pH 3.0–6.0; optimum activity was observed at 50°C and pH 4.5. In a specific concentration range, the enzyme activity was enhanced by K +, Ca 2+, and Na +, but was strongly inhibited by Fe 3+, SDS, and EDTA-Na 2. This study provides a basis for understanding the purification of naringinase and for further studies of the related mechanism underlying the bioconversion of bioactive natural products with naringinase.Key words: Aspergillus niger ; liquid fermentation; naringinase; purification; enzymatic properties柚苷酶（EC 3.2.1.40）是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成，同时具有α-L-鼠李糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。
柚苷酶选育方案
柚苷酶菌种选育方案一第一阶段：菌种的培养与选育一、培养产柚苷酶菌种培养基配方：低糖柚苷培养基（500ml)MgSO4 0.5%, ——2.5gK2HPO4 0.1% ——0.5g, KCL0.5%, ——2.5g蔗糖1%，——5.0gNaNO30.3%, ——1.5g柚苷0.5%，——2.5g琼脂1.5%。
——7.5gPH自然（来自西南农业大学柚苷酶生产菌的选育）。
实验仪器：烧杯(200ml 一个)，三角瓶（1000ml 一支），量筒（100ml），玻棒，容量瓶（500ml 一支）天平(0.1 和0.0001) ，药匙，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器,精密PH计，棉花，纱布，牛皮纸，标签纸，麻绳，皮筋。
配制培养基：1、按上述配方称量药品，置于烧杯中加少许水搅拌至全溶；2、将混合液倒入500ml的容量瓶中定容；3、将定容混合液倒入1000ml烧杯中，加入1.5% 琼脂(先溶），用磁力搅拌器加热搅拌融化;4、将融液分装到1000ml的三角瓶中，加塞，用牛皮纸包扎，灭菌锅灭菌（0.1MPa，121度，灭菌30min）；5、贴上标签，灭菌完后，冷却放入培养箱保存（待用）。
2，接种仪器及药品：柚苷酶，蒸馏水，无菌水，新制低糖柚苷培养基涂布器，培养皿(20个) ，称量纸，移液枪，移液枪盒，0.1和1.0的移液枪头， 1.5ml 离心管（10个），离心管盒，培养箱，超净台，电子天平（0.0001），高压灭菌锅，橡皮筋，旧报纸，。
菌种选育：1、用酒精擦拭天平外表面，之后放置在超净台过夜灭菌；2、将移液枪枪头放入移液枪枪盒，离心管放入离心管盒(离心管单独灭菌，称量纸，牛皮纸），并分别用旧报纸包好，同时也将培养皿，涂布器，烧杯，手套用旧报纸包装好，将50ml二次蒸馏水加入三角瓶中加塞包扎，分次用高压灭菌锅灭菌（0.1MPa，121度，灭菌30min），之后放入超净台灭菌半小时；3、取出柚苷酶在超净台中戴手套打开包装，用灭菌后的称量纸称量50mg酶粉末；4、取六只灭菌好的1.5ml离心管，编号（1——7），分别用移液枪加入0.9ml无菌水，（3、4步双人同时操作）；5、将粉末倒入1号离心管中，震荡充分溶解，用移液枪取出0.1ml溶液加入2号离心管中，震荡混匀，在3——7号进行同样操作，依次配备出10-1（2号管），10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。
微生物来源柚苷酶的研究进展及应用
微生物来源柚苷酶的研究进展及应用张林河;方柏山【期刊名称】《化工进展》【年(卷),期】2013(32)5【摘要】柚皮苷是影响柚子汁品味的最主要因素，柚苷酶具有将柚皮苷分解为普鲁宁、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物质的功能，并且这些物质已广泛用于制药和饮料行业。
本文介绍了近年来国内外微生物来源的柚苷酶的研究、酶学特性、酶活测定、结构与功能等，表明细菌来源的柚苷酶最适温度为37～70℃，最始pH值为4.5～8.0；真菌来源的柚苷酶最适温度为30～75℃，最始pH值为4.0～11.0。
介绍了柚苷酶及其相关产物在食品、饮料和制药工业中的应用进展，发现柚苷酶不仅具有脱苦的作用，还对人类的身体健康具有重要作用。
展望了今后的研究方向，应该从柚苷酶高产菌株的选育、发酵产酶的工艺优化和酶的应用等方面开展工作，大幅度提高柚苷酶的产酶水平。
%Naringin is the principal factor which bitters the taste of grapefruit juice. Naringin could be hydrolyzed by naringinase into prunin,rhamnose,glucose,and naringenin,which have wide applications in the pharmaceutical and beverage industry. This paper provides an overview of the studies on microbial originnaringinase,purification,characterization and determination of enzyme activity as well as protein structure and function. The optimum temperature of naring inase from bacteria is from 37 ℃ to 70 ℃ while the optimal pH is in the range of 4.5 to 8.0;the optimum temperature of naringinase from fungal is from 30℃to 75 ℃ while the optimal pH is in therange of 4.0 to 11.0. The applications of naringinase and its various products in food,beverage,and pharmaceutical are also presented,showing that naringinase could not only debitter the fruit juice but also play an important role in human health. In addition,the development trends and potential applications of naringinase are also prospected. The research emphasis should be placed on screening ideal microbe strains and fermentation process optimization to enhance naringinase.【总页数】8页(P1108-1115)【作者】张林河;方柏山【作者单位】华侨大学化工学院，福建厦门 361021;华侨大学化工学院，福建厦门 361021; 厦门大学化学化工学院，福建厦门 361005【正文语种】中文【中图分类】TS201.1【相关文献】1.微生物来源蔗糖异构酶的研究进展及应用 [J], 李莎;徐虹2.微生物硫酸酯酶研究进展：来源、催化机制及应用 [J], 张丹平;何玉财3.微生物来源的L-阿拉伯糖异构酶的研究进展及应用前景 [J], 程丽芳;沐万孟;张涛;江波4.微生物来源的尿酸氧化酶的研究进展及应用前景 [J], 陈志禹;何秀萍;张博润5.海洋微生物来源木聚糖酶研究进展 [J], 田艳杰;徐佳;贾腾飞;马苗苗;张慧姗;王燕;周晨妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
柚皮苷的生物活性研究进展
DOI ：10.3969/j.issn.1672-9463.2018.03.034柚皮苷的生物活性研究进展金元宝 刘萍 刘小根 金刚▲基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目（编号：GJJ151495）作者单位：343000 江西吉安，吉安职业技术学院现代农林工程学院（金元宝）；上海市东方医院吉安医院中医科（刘萍）；江西省国鼎检测技术有限公司（刘小根）；深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院（金刚）通讯作者：金刚我国是世界柑橘的主要起源中心，也是世界柑橘的生产大国。
柑橘类水果及其果汁对心血管病及癌症等预防和治疗的作用已被广泛研究，其主要活性成分是黄酮类化合物，如柚皮苷、橙皮苷、圣草酚、异野樱素及它们各自的糖苷类物质。
其中最具有代表性的是柚皮苷。
柚皮苷是存在于柑橘属果实、果皮和果肉中的一种二氢黄酮糖苷（图1），又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷，也是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中药的主要有效成分之一。
柚皮苷含量随品种、产地的不同而存在较大差异，通常未成熟的果实内含量较高。
图1 柚皮苷分子结构式柚皮苷具有多种生物学活性，包括抗过敏反应[1]，抗氧化，降血脂，对杂环胺类物质等致突变性的抑制作用，抗癌，对胃溃疡的防治，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、埃氏大肠杆菌及某些真菌的抑制作用，抗炎，对某些毒物的拮抗作用，降血脂，降血胆固醇，解痉，镇痛，改善微循环和软骨组织细胞功能作用，降低毛细血管通透性和骨关节病变率作用，促进一些药物在人体内的吸收和代谢[2]，促进成骨细胞增殖和分化、抑癌等多种药理活性[3]。
本研究主要综述柚皮苷在骨质疏松症、动脉粥样硬化症、癌症、糖尿病、砷中毒等方面的作用。
1 抗骨质疏松症骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微细结构破坏、骨骼的强度减低和骨折危险性增加为特征的一种全身代谢性疾病，常见于绝经后妇女和老年人。
随着我国老年人口的增加，骨质疏松症发病率呈上升趋势。
柚皮苷能增加成骨细胞标志蛋白[如骨钙蛋白、骨桥蛋白、护骨素及骨形成蛋白-2（BMP-2）]的表达，同时还能抑制RANKL[The receptor activator of nuclear factor-kappa B （NF-κB） ligand （RANKL）]诱导的NF-κB 和ERK 信号传递活性和破骨细胞基因的蛋白表达，从而导致破骨细胞不能正常形成，因此，起到延缓骨质疏松的作用，促进成骨细胞的增殖与分化[4，5]。
柚皮苷药物动力学及生物活性研究新进展
柚皮苷药物动力学及生物活性研究新进展
黄凤香;林家逊
【期刊名称】《华夏医学》
【年(卷),期】2009(022)004
【摘要】@@ 柚皮苷是一种广泛存在于芸香科的植物柚,我国是柚的生产大国,柚果种植面积和产量均居世界首位,但由于受多种因素的限制,除极少部分直接作为中药材或作为提取果胶和香精油的原料外,90%以上直接废弃,其中含有大量的柚皮苷等生物活性物质未能得到充分利用.
【总页数】3页(P777-779)
【作者】黄凤香;林家逊
【作者单位】桂林医学院药学院,广西,桂林,541004;桂林医学院药学院,广西,桂林,541004
【正文语种】中文
【中图分类】R969.1
【相关文献】
1.柚皮苷生物活性和药代动力学研究新进展 [J], 苏玲;刘启德
2.柚皮苷的生物活性研究进展 [J], 金元宝;刘萍;刘小根;金刚
3.柑桔生物类黄酮柚皮苷生物活性的研究进展 [J], 张甘良;汪钊;朱国孟
4.柚皮苷双席夫碱的合成及生物活性研究 [J], 郭莉霞;孙斌
5.兽医药物动力学研究新进展——兽医群体药物动力学 [J], 刘雅红;冯淇辉
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Ｃ３
７３７ ８９６．３ １６３３．３ ８１６．６５
Ｃ２ ９４４．４ ９４２．８５ １８８７．２５ ９４３．６２５
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ
Ｃ３ ７６８．５ ７７４．７ １５４３．２ ７７１．６ Ｃｌ １０４９．４ ｌ０８８ ２１３７．４ １０６８．７ Ｃ３ ２９３．６ ２６７．１５ ５６０．７５ ２８０．３７５ Ｃ１ ６９５．８ ６６０．１ １３５５．９ ６７７．９５
江 西林 业科 技
２０１２年第 ３期
柚苷 酶活力测定方法 的研 究
龙俊 敏
（江西生物科技职业学 院动科 系，江西南 昌 ３３００２０）
摘 要 ：研 究在不 同酶活测定条件 下，黑曲霉 ３－９液体摇瓶培 养产柚苷酶的最佳测定条件组合。通过 （３ ）正交实验表 明：在水解温度 ４０℃，一缩二 乙二醇（ｃ４Ｈｍ０３）的加 量为 ５ ｍＬ，显 色时间 ５ ｍｉｎ的条件 组合 下酶活力最 高，达到 了 ｌ ０６８．７ Ｕ／
１ ｅｍ比色杯测定其光密度 ＯＤ值 ，详细操作步骤见表 ２。 ２）样品柚苷酶活力计算：①根据柚皮苷标准曲线 ，
首先计算 出管号 ２柚苷酶含量为 ｘ标。②然后分别根 据柚 皮 苷标 准 曲线计 算 出供测样 品残 留的柚 皮苷 的含 量 为 ｘ样。③ 样 品柚 苷酶 活力 ＝（ｘ标一Ｘ样）ｘＮ／ｔ，式 中
１０
０
１０ ０．１１０
１０ ０．３５８
１０ ０．５５２
１０ ０．７４２
１０ ０．９４２
１０ １ ２０７
１．２．５ Ｌ９（３ 试验 设计 。影 响柚 苷 酶 活力 测定 的因 素有 很 多 ，笔 者根 据 以往经 验 ，挑选 和确定 了若 干对 试验 指 标影 响最 大最 有 经济 意义 的 因素 。这 些 因素是 酶水 解 时 问 、一 缩二 乙二 醇用 量 和显色 时 间。本 试验采 取三 水 平三 因素 （３ ）试 验 ，试 验设 计见 表 ３、表 ４。 ２ 结果与分析 ２．１ 正 交试 验 酶 活 测 定 结 果及 直观 分析
表 １
柚皮苷标准 曲线的测定
试 ４００ ｍＬ柚皮 ９０％ 。ｌ／Ｌ 蒸 馏 ４ｏ 水 ０Ｄ 值
管 苷标准溶液 ＤＥＧ溶 Ｎａ（ 水 ．浴中 （入４２０
（ｘ标一ｘ样）为柚 苷 酶水解 柚皮 苷 的微克 数 ；ｔ为柚 苷酶 水 解柚 皮 苷 时问 ，本试 验 ｔ＝３０ ｒ ａｉｎ；Ｎ为柚 苷酶 样 品 的 稀 释倍 数 。
度 柚 皮 苷标 准 溶 液 的配 制及 测 定 ，见 表 １。表 １中 用 ０，４０，１２０，２００，２８０，３６０，４４０共 ７个 不 同 含 量 的柚 皮 苷 ，配 置标 准溶 液 。利 用柚 皮苷 在 碱性 条件 下 及 ４０℃
加 入 柚 皮 苷 酶 解 液 １ ｍＬ和 ９０％的 一 缩 二 乙二 醇 ５ ｍＬ，及 ４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶 液 ０．１ ｍＬ，蒸 馏 水 ３．９ ｍＥ（总 反应 体积 １０ ｍＥ），４０℃水 浴水 解 ｌ０ ｍｉｎ，同时以 １ ｍＬ对
号 ｍＬ
液／
１
０
０
５
２
０．１
４０
５
３
０．３
１２０
５
４
０．５
２００
５
５
０．７
２８０
５
６
０．９
３６０
５
７
１．１
４＿４０
５
／ｍＬ ０．１ ０．１ ０．１ Ｏ．１ ０．１ Ｏ．１ ０．】
／
间／ｍｉｎ ｎｍ）
４．９ ４．８ ４．６ ４．４ ４－２ ４．０ ３．８
柚 皮 苷 （Ｎａｒｉｎｇｉｎ），分 子 式 ｃ Ｈ ０ ，分 子 量 为 ５８０．５３。 图 １为柚 皮 苷 的结构 式 。
Ｈ２ＣＣｌＨ Ｏ
嘲
图 １ 柚 皮 苷 的 结构 式
消 除桔 子汁 的苦味 ，目前 主要 应 用 的有酶 法 、吸 附 法 、超临界流体萃取脱苦和代谢脱苦法等［３１。其中酶法 脱苦具有专一性强 ，对桔子汁的营养成分无破坏 、效果 好 、成本低等优点 ，是 目前较为理想的方法 。微生物中 能分解柚皮苷的菌种很多 ，其中以曲霉属为主。柚苷酶 可 以分 解柚 皮 苷 。柚 苷 酶 由鼠李 糖酶 和 黄 酮类 一Ｂ一葡
至 １００ ｍＬ，即成 ４００ Ｉｘｇ／ｍＬ的柚皮苷标准溶液。③４．０ ｒａｉｎ，同时 以 １ ｍＬ蒸 馏 水 作 同样 处 理 作对 照 （在理 论
ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶 液 的配 制 ：准 确 称 取 氢 氧 化 钠 分 析 纯 上计算对照的柚皮苷溶液的浓度为 ４００ Ｉｘｇ／ｍＬｘ２ ｍＬ／
Ｏ ０
１００
２００
３００
柚 皮 苷 微 克 数
图 ２ 柚皮苷标准 曲线
４００
５００ ｕ ｇ
量瓶 中 即成 。其 次 ，分 别 将 溶液 Ａ ４１．０ ｍＬ和溶 液 Ｂ 柚皮 苷 的微 克数 表示 为一个 酶 活力单位 （ｕ）。
９．８ ｍＬ加 于 １００ ｍＬ同一 容 量 瓶 中 ，用蒸 馏 水 定 容至 １００ ｍＬ即成 。＠４００ Ｉｘｇ／ｍＬ柚皮苷标准溶液 的配制 ： 称 取 含 量 ９８％的柚 皮 苷 ４０．８２ ｍｇ于 １００ ｍＬ烧 杯 中 ，
Ｏ．２
Ａ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ冰 醋 酸 （１１．５ ｍＬ冰 醋酸 于 １ ０００ ｍＬ容量 瓶 中 ，用 蒸 馏 水 定 容 至 １ ０００ ｍＬ即 成 ；溶 液 Ｂ，Ｏ．２ ｍｏｌ／Ｌ醋 酸 钠 ，称 取 醋 酸 钠 （ＣＨ ＣＯＯＮａ １．６４ ｇ或 ＣＨＣＯＯＮａ·３Ｈ：Ｏ ２．７２ ｇ），用蒸 馏 水定 容 在 １００ ｍＬ容
①样 品柚 苷 酶对柚 皮苷 的酶 解作用 ：柚 苷 酶样 品 的制 备 ：柚 苷酶 摇瓶 发 酵液 过滤 后用 ｐＨ ４．０醋 酸缓 冲 液稀 释 ５０倍 。在 １５ｘ１５０ ｍＬ试管 中分别 加入 ４００ ｇ／
用少 量 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ醋 酸缓 冲溶 液 溶解 后 ，倒 入 １００ ｍＬ ｍＬ柚 皮 苷 标 准 液 ２ ｍＬ和 ０．２ ｍＬ／Ｌ ｐＨ ４．０醋 酸缓 冲
１．２
转 ／ｍｉｎ培养 ４～５ ｄ，发 酵液 过 滤 ，测定 滤 液 中柚 苷 酶 活
ｌ
力 。 １．２．４ 酶 活测 定的 原始 方 法 １．２．４．１ 相关溶液 的配制 。０３０．２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ４．０醋酸缓
０ ８
詈 ０—６
。 Ｏ·４
冲溶 液 的 配制 【ｌｌ：首 先分 别 配好 溶液 Ａ和 溶液 Ｂ；溶 液
温 度 中 ，能 与一 缩 二 乙二醇 发生 反应 。柚 皮 苷起 显色 反 照液 代替 酶解液作 同样处理 以作 对照 ，在 ４２０ ｒｉｍ处理用
应 （黄色 ），生成 一 种 叫柚皮 苷 二氢查 尔 酮 的物质 。利 用 此 反应 ，可 以配 制 出柚皮 苷 的标 准溶 液 ，并 绘 制 出标 准 曲线 （图 ２）。 １．２．４．３柚苷 酶 活力测 定 。 １）柚 苷 酶活力 的定义 ：在 ４０ ｏＣ，ｐＨ ４．０条 件 下 ，每分 钟 每 毫 升 （或每 克 ）酶液 分 解
容量 瓶 中 ，再 用少 量 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ醋酸 缓 冲液 冲洗 烧 杯 ， 液 ２ ｍＬ ４０ ｏＣ恒温水 浴 锅 中预热 ５ ｍｉｎ，然后 加入 预 先 一 并倒人容量瓶中 ，然后用 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ醋酸缓 冲液定容 稀释 的柚 皮 苷样 品液 １ ｍＬ，充 分摇 匀 ，４０℃下 保 温 ３０
ｍＴ 。
关键 词 ：黑曲霉 ３－９；柚苷酶 ；柚 皮苷
分 类 号 ：￥６６６：Ｑ９４６．５
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００６—２５０５（２０１２）０３—００２８—０３
０ 前言 柑 桔类 水 果 包 括 柠 檬 、脐 橙 柚 、葡 萄 柚 等 ，是 世 界
上最 主要 的亚 热带 水果 之 一 。柑桔 的果 实 中含 有 多种 营养 成 分 ，除含 有 丰 富 的葡 萄 糖 、果糖 等 ，还 含有 一 定 量 的硫 胺 素 、核 黄 素 、生物 类 黄 酮 、类 胡 萝 卜素等 生 理 活性 物 质 ，因此 开展 柑 桔 加工 和 综合 利 用 ，很 有必 要 Ｉｌ】。 但是 柑桔加工过程 中会 出现 明显苦 味 ，使 许多 消费 者难 以接 受 ，这就 限 制 了其 在食 品 工 业 中的广 泛 应 用 。柑 桔 中苦 味物 质 主要 是 柚 皮 苷 和柠 檬 苦 素 ，其 中柚皮 苷 含 量较 大 ，如无 核桔 汁柚皮 苷含 量达到 ３０ ｍ ｇ左右［２１。
萄糖 苷酶 组成 ，它 能使 柚 皮苷 经 过柚 皮 素 一Ｂ一葡 萄 糖 苷 中间产 物最 终水解 生 成柚 皮素 ，因此此 酶 可 以广 泛 应 用 于桔 子汁 、桔 子酒 、桔子 皮等 的脱 苦 。 １ 材料与方法 １．１ 材 料 １．１．１ 菌种 。黑 曲霉 ３－９，江西 农 业 大学 生物 技 术研 究 中心 自行 分离 筛选 获得 。 １．１．２ 斜面培养基 ＼选择｝生分 离平板培养基 （％）。 Ｍｇ— ＳＯ４·７Ｈ２０，０．５；桔 皮 粉 ，０．５；Ｋ２ＨＰＯ４，０．５；ＫＣ１，０．５；ＦｅＳ一 ０４·５Ｈ２０，０．０１；琼脂 ，２．０；ｐＨ值 自然 。 １．１＿３ 液体摇瓶发酵培养基配方（％）。桔皮粉 ，１；豆渣 （湿 ），５；黄 豆 粉 ，２； 蔗 糖 ，０．５；ＣａＣ１２，０．１；ＺｎＳＯ４，０．１； Ｋ２ＨＰ０４，０．１；ＭｇＳ０４￣７Ｈ２０，０．１；自来水 ，１００；ｐＨ值 ６．５。 １．１．４ 主 要试 剂 。① 柚皮 苷 ，含 量 ９８％，陕 西 慧科 植 物 开发 有 限公 司提供 ；② 一缩 二 乙二 醇 ；冰 醋酸 ，醋酸 钠 ， 氢氧化钠等（均为分析纯）；③桔皮粉 、豆饼粉 、含水量约 ４０％的豆渣 （自制 ）。 １．１．５ 主要仪器设备与玻璃器皿 。①仪器设备：７２２分 光光 度 计 、摇 床 、离心 机 、超净 工作 台 、培 养箱 、灭菌 锅 ； ②玻 璃 器皿 ：２０ ｍＬ带塞 试管 、平 皿 、容 量 瓶 、移 液管 。 １．２ 方 法 １．２．１ 菌种 的斜面培养。将供试菌株接种到斜面培养 基上 ，培养 ，备用 。 １．２．２ 摇瓶培养基的制备。按供试配方称料 ，加入所需 水 的体积 ，隔水煮沸后维持 ２０ ｍｉｎ，搅 拌均匀分装 于 ２５０ ｍＬ三角瓶 ，每瓶 ３０ ｍＬ，绒布塞瓶 口，并用牛皮纸 包扎 ，１２１℃消毒 ３０ ｍｉｎ，备用。