柚苷酶活力测定方法的研究

Ｃ３
７３７ ８９６．３ １６３３．３ ８１６．６５
Ｃ２ ９４４．４ ９４２．８５ １８８７．２５ ９４３．６２５
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ
Ｃ３ ７６８．５ ７７４．７ １５４３．２ ７７１．６ Ｃｌ １０４９．４ ｌ０８８ ２１３７．４ １０６８．７ Ｃ３ ２９３．６ ２６７．１５ ５６０．７５ ２８０．３７５ Ｃ１ ６９５．８ ６６０．１ １３５５．９ ６７７．９５
江 西林 业科 技
２０１２年第 ３期
柚苷 酶活力测定方法 的研 究
龙俊 敏
（江西生物科技职业学 院动科 系，江西南 昌 ３３００２０）
摘 要 ：研 究在不 同酶活测定条件 下，黑曲霉 ３－９液体摇瓶培 养产柚苷酶的最佳测定条件组合。通过 （３ ）正交实验表 明：在水解温度 ４０℃，一缩二 乙二醇（ｃ４Ｈｍ０３）的加 量为 ５ ｍＬ，显 色时间 ５ ｍｉｎ的条件 组合 下酶活力最 高，达到 了 ｌ ０６８．７ Ｕ／
１ ｅｍ比色杯测定其光密度 ＯＤ值 ，详细操作步骤见表 ２。 ２）样品柚苷酶活力计算：①根据柚皮苷标准曲线 ，
首先计算 出管号 ２柚苷酶含量为 ｘ标。②然后分别根 据柚 皮 苷标 准 曲线计 算 出供测样 品残 留的柚 皮苷 的含 量 为 ｘ样。③ 样 品柚 苷酶 活力 ＝（ｘ标一Ｘ样）ｘＮ／ｔ，式 中
１０
０
１０ ０．１１０
１０ ０．３５８
１０ ０．５５２
１０ ０．７４２
１０ ０．９４２
１０ １ ２０７
１．２．５ Ｌ９（３ 试验 设计 。影 响柚 苷 酶 活力 测定 的因 素有 很 多 ，笔 者根 据 以往经 验 ，挑选 和确定 了若 干对 试验 指 标影 响最 大最 有 经济 意义 的 因素 。这 些 因素是 酶水 解 时 问 、一 缩二 乙二 醇用 量 和显色 时 间。本 试验采 取三 水 平三 因素 （３ ）试 验 ，试 验设 计见 表 ３、表 ４。 ２ 结果与分析 ２．１ 正 交试 验 酶 活 测 定 结 果及 直观 分析
表 １

柚皮苷标准 曲线的测定
试 ４００ ｍＬ柚皮 ９０％ 。ｌ／Ｌ 蒸 馏 ４ｏ 水 ０Ｄ 值
管 苷标准溶液 ＤＥＧ溶 Ｎａ（ 水 ．浴中 （入４２０
（ｘ标一ｘ样）为柚 苷 酶水解 柚皮 苷 的微克 数 ；ｔ为柚 苷酶 水 解柚 皮 苷 时问 ，本试 验 ｔ＝３０ ｒ ａｉｎ；Ｎ为柚 苷酶 样 品 的 稀 释倍 数 。
度 柚 皮 苷标 准 溶 液 的配 制及 测 定 ，见 表 １。表 １中 用 ０，４０，１２０，２００，２８０，３６０，４４０共 ７个 不 同 含 量 的柚 皮 苷 ，配 置标 准溶 液 。利 用柚 皮苷 在 碱性 条件 下 及 ４０℃
加 入 柚 皮 苷 酶 解 液 １ ｍＬ和 ９０％的 一 缩 二 乙二 醇 ５ ｍＬ，及 ４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶 液 ０．１ ｍＬ，蒸 馏 水 ３．９ ｍＥ（总 反应 体积 １０ ｍＥ），４０℃水 浴水 解 ｌ０ ｍｉｎ，同时以 １ ｍＬ对
号 ｍＬ
液／
１
０
０
５
２
０．１
４０
５
３
０．３
１２０
５
４
０．５
２００
５
５
０．７
２８０
５
６
０．９
３６０
５
７
１．１
４＿４０
５
／ｍＬ ０．１ ０．１ ０．１ Ｏ．１ ０．１ Ｏ．１ ０．】
／
间／ｍｉｎ ｎｍ）
４．９ ４．８ ４．６ ４．４ ４－２ ４．０ ３．８
柚 皮 苷 （Ｎａｒｉｎｇｉｎ），分 子 式 ｃ Ｈ ０ ，分 子 量 为 ５８０．５３。 图 １为柚 皮 苷 的结构 式 。
Ｈ２ＣＣｌＨ Ｏ
嘲
图 １ 柚 皮 苷 的 结构 式
消 除桔 子汁 的苦味 ，目前 主要 应 用 的有酶 法 、吸 附 法 、超临界流体萃取脱苦和代谢脱苦法等［３１。其中酶法 脱苦具有专一性强 ，对桔子汁的营养成分无破坏 、效果 好 、成本低等优点 ，是 目前较为理想的方法 。微生物中 能分解柚皮苷的菌种很多 ，其中以曲霉属为主。柚苷酶 可 以分 解柚 皮 苷 。柚 苷 酶 由鼠李 糖酶 和 黄 酮类 一Ｂ一葡
至 １００ ｍＬ，即成 ４００ Ｉｘｇ／ｍＬ的柚皮苷标准溶液。③４．０ ｒａｉｎ，同时 以 １ ｍＬ蒸 馏 水 作 同样 处 理 作对 照 （在理 论
ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶 液 的配 制 ：准 确 称 取 氢 氧 化 钠 分 析 纯 上计算对照的柚皮苷溶液的浓度为 ４００ Ｉｘｇ／ｍＬｘ２ ｍＬ／
Ｏ ０
１００
２００
３００
柚 皮 苷 微 克 数
图 ２ 柚皮苷标准 曲线
４００
５００ ｕ ｇ
量瓶 中 即成 。其 次 ，分 别 将 溶液 Ａ ４１．０ ｍＬ和溶 液 Ｂ 柚皮 苷 的微 克数 表示 为一个 酶 活力单位 （ｕ）。
９．８ ｍＬ加 于 １００ ｍＬ同一 容 量 瓶 中 ，用蒸 馏 水 定 容至 １００ ｍＬ即成 。＠４００ Ｉｘｇ／ｍＬ柚皮苷标准溶液 的配制 ： 称 取 含 量 ９８％的柚 皮 苷 ４０．８２ ｍｇ于 １００ ｍＬ烧 杯 中 ，
Ｏ．２
Ａ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ冰 醋 酸 （１１．５ ｍＬ冰 醋酸 于 １ ０００ ｍＬ容量 瓶 中 ，用 蒸 馏 水 定 容 至 １ ０００ ｍＬ即 成 ；溶 液 Ｂ，Ｏ．２ ｍｏｌ／Ｌ醋 酸 钠 ，称 取 醋 酸 钠 （ＣＨ ＣＯＯＮａ １．６４ ｇ或 ＣＨＣＯＯＮａ·３Ｈ：Ｏ ２．７２ ｇ），用蒸 馏 水定 容 在 １００ ｍＬ容
①样 品柚 苷 酶对柚 皮苷 的酶 解作用 ：柚 苷 酶样 品 的制 备 ：柚 苷酶 摇瓶 发 酵液 过滤 后用 ｐＨ ４．０醋 酸缓 冲 液稀 释 ５０倍 。在 １５ｘ１５０ ｍＬ试管 中分别 加入 ４００ ｇ／
用少 量 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ醋 酸缓 冲溶 液 溶解 后 ，倒 入 １００ ｍＬ ｍＬ柚 皮 苷 标 准 液 ２ ｍＬ和 ０．２ ｍＬ／Ｌ ｐＨ ４．０醋 酸缓 冲
１．２
转 ／ｍｉｎ培养 ４～５ ｄ，发 酵液 过 滤 ，测定 滤 液 中柚 苷 酶 活
ｌ
力 。 １．２．４ 酶 活测 定的 原始 方 法 １．２．４．１ 相关溶液 的配制 。０３０．２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ４．０醋酸缓
０ ８
詈 ０—６
。 Ｏ·４
冲溶 液 的 配制 【ｌｌ：首 先分 别 配好 溶液 Ａ和 溶液 Ｂ；溶 液
温 度 中 ，能 与一 缩 二 乙二醇 发生 反应 。柚 皮 苷起 显色 反 照液 代替 酶解液作 同样处理 以作 对照 ，在 ４２０ ｒｉｍ处理用
应 （黄色 ），生成 一 种 叫柚皮 苷 二氢查 尔 酮 的物质 。利 用 此 反应 ，可 以配 制 出柚皮 苷 的标 准溶 液 ，并 绘 制 出标 准 曲线 （图 ２）。 １．２．４．３柚苷 酶 活力测 定 。 １）柚 苷 酶活力 的定义 ：在 ４０ ｏＣ，ｐＨ ４．０条 件 下 ，每分 钟 每 毫 升 （或每 克 ）酶液 分 解
容量 瓶 中 ，再 用少 量 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ醋酸 缓 冲液 冲洗 烧 杯 ， 液 ２ ｍＬ ４０ ｏＣ恒温水 浴 锅 中预热 ５ ｍｉｎ，然后 加入 预 先 一 并倒人容量瓶中 ，然后用 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ醋酸缓 冲液定容 稀释 的柚 皮 苷样 品液 １ ｍＬ，充 分摇 匀 ，４０℃下 保 温 ３０
ｍＴ 。
关键 词 ：黑曲霉 ３－９；柚苷酶 ；柚 皮苷
分 类 号 ：￥６６６：Ｑ９４６．５
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００６—２５０５（２０１２）０３—００２８—０３
０ 前言 柑 桔类 水 果 包 括 柠 檬 、脐 橙 柚 、葡 萄 柚 等 ，是 世 界
上最 主要 的亚 热带 水果 之 一 。柑桔 的果 实 中含 有 多种 营养 成 分 ，除含 有 丰 富 的葡 萄 糖 、果糖 等 ，还 含有 一 定 量 的硫 胺 素 、核 黄 素 、生物 类 黄 酮 、类 胡 萝 卜素等 生 理 活性 物 质 ，因此 开展 柑 桔 加工 和 综合 利 用 ，很 有必 要 Ｉｌ】。 但是 柑桔加工过程 中会 出现 明显苦 味 ，使 许多 消费 者难 以接 受 ，这就 限 制 了其 在食 品 工 业 中的广 泛 应 用 。柑 桔 中苦 味物 质 主要 是 柚 皮 苷 和柠 檬 苦 素 ，其 中柚皮 苷 含 量较 大 ，如无 核桔 汁柚皮 苷含 量达到 ３０ ｍ ｇ左右［２１。
萄糖 苷酶 组成 ，它 能使 柚 皮苷 经 过柚 皮 素 一Ｂ一葡 萄 糖 苷 中间产 物最 终水解 生 成柚 皮素 ，因此此 酶 可 以广 泛 应 用 于桔 子汁 、桔 子酒 、桔子 皮等 的脱 苦 。 １ 材料与方法 １．１ 材 料 １．１．１ 菌种 。黑 曲霉 ３－９，江西 农 业 大学 生物 技 术研 究 中心 自行 分离 筛选 获得 。 １．１．２ 斜面培养基 ＼选择｝生分 离平板培养基 （％）。 Ｍｇ— ＳＯ４·７Ｈ２０，０．５；桔 皮 粉 ，０．５；Ｋ２ＨＰＯ４，０．５；ＫＣ１，０．５；ＦｅＳ一 ０４·５Ｈ２０，０．０１；琼脂 ，２．０；ｐＨ值 自然 。 １．１＿３ 液体摇瓶发酵培养基配方（％）。桔皮粉 ，１；豆渣 （湿 ），５；黄 豆 粉 ，２； 蔗 糖 ，０．５；ＣａＣ１２，０．１；ＺｎＳＯ４，０．１； Ｋ２ＨＰ０４，０．１；ＭｇＳ０４￣７Ｈ２０，０．１；自来水 ，１００；ｐＨ值 ６．５。 １．１．４ 主 要试 剂 。① 柚皮 苷 ，含 量 ９８％，陕 西 慧科 植 物 开发 有 限公 司提供 ；② 一缩 二 乙二 醇 ；冰 醋酸 ，醋酸 钠 ， 氢氧化钠等（均为分析纯）；③桔皮粉 、豆饼粉 、含水量约 ４０％的豆渣 （自制 ）。 １．１．５ 主要仪器设备与玻璃器皿 。①仪器设备：７２２分 光光 度 计 、摇 床 、离心 机 、超净 工作 台 、培 养箱 、灭菌 锅 ； ②玻 璃 器皿 ：２０ ｍＬ带塞 试管 、平 皿 、容 量 瓶 、移 液管 。 １．２ 方 法 １．２．１ 菌种 的斜面培养。将供试菌株接种到斜面培养 基上 ，培养 ，备用 。 １．２．２ 摇瓶培养基的制备。按供试配方称料 ，加入所需 水 的体积 ，隔水煮沸后维持 ２０ ｍｉｎ，搅 拌均匀分装 于 ２５０ ｍＬ三角瓶 ，每瓶 ３０ ｍＬ，绒布塞瓶 口，并用牛皮纸 包扎 ，１２１℃消毒 ３０ ｍｉｎ，备用。
收 稿 日期 ：２０１２－０２—２７
作者简 介 ：龙 俊敏 ，女 ，本科 ，助教 ，主要从事生物技术的教学和研究工作。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｏｎｇｊｕｎｍｉｎ１１１６＠１６３．ｃｏｍ · ２８ ·
１．２．３ 接 种 摇瓶 发 酵 。按 摇瓶 设计 要求 ，每 支供 试斜 面
１·４
用接 种 铲接 ２个 三角 瓶 ，包 扎 好 后上 摇 床 ，３Ｏ ｑＣ，２００
１６．０ ｇ，用 蒸馏 水 定容 至 １００ ｍＬ的容量 瓶 中 ，即成 。
（２ ｍＬ＋２ ｍＬ＋ｌ ｍＬ）＝１６０（ ｍＬ）。
１．２．４．２ 标 准 曲线 的测 定［２－３］。柚皮 苷 含量 的测定 ：采 用
② 酶解 液 中残 留柚 皮苷 含量 的测定 ：按 柚皮 苷标
中林改 良 Ｄａｖｉｓ法和萃取中林改 良 Ｄａｖｉｓ法 。不同浓 准 曲线 制作 方 法进 行 测定 ，在 １５ｘ１５ ｍＬ试 管 中分别
表 ５中酶 活分 析结 果显 示 ：对酶 活影 响显 著 的 因
· ２９ ·
表 ２
样 品 酶 活 力 测 定
表 ３
Ｌ。（３４）试 验 设 计
表 ５
酶活 测定 结果
ｌ
２５
３
５
２
３０
４
１Ｏ
３
３５
５
ｌ５
Ｃｌ ９９６．３ ９８１．５ １９７７．８ ９８８．９ Ｃ２ １０６３ １Ｏ４０ ２１０３ １０５１．５