吸光光度法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
'
c(1 ) (1 ) K 2 2 c c 2
A1
x A 1
x
y A1
y A 2
x y bc bcy 1 x 1
A 2 A 2
bcx bcy
x 2 y 2
κ为物质的特征参数，
可通过配制标准溶液测得。
解联立方程，可求得Cx，Cy
例：以分光光度法测定某合金钢中的锰和铬。称取 1.000g钢样，溶解后稀释至50.00mL。将其中的Cr氧化 成Cr2O72-，Mn氧化成MnO4-。然后在440nm和545nm 用1.0cm吸收池测量吸光度列于下表。求此合金钢中锰 和铬的质量分数。(MMn=54.94，MCr=52.00) A 440nm 545nm 0.204 0.860 КMn 95.0 2.35×103 КCr 369.0 11.0
二、物理化学常数的测定
1、弱酸弱碱解离常数的测定
2、络合物组成及稳定常数的测定
1.弱酸弱碱离解常数的测定
A HB B
HB
HB
H＋＋B
B HB B
Ka＝[H+][B]/[HB]
配制三种pH不同, c相同的溶液,测A(b=1). 1、 pH1≈pKa
A AHB AB HB [HB ] B [B ]
没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有 色化合物再测定－－ 显色反应
【类型】 氧化还原和络合反应 （M + nR = MRn ） 影响显色反应的因素
酸度的影响 显色剂的用量 温度的选择 时间的选择 有机溶剂和表面活性剂 共存离子的干扰
§11.4 吸光度的测量及误差控制
一、测量波长和参比溶液的选择
2.络合物的组成及稳定常数的测定 摩尔比法测络合比
M + nR = MRn
CM固定； CMRn CR从 0 开始增大 A
CR
n
CR/CM
适用于解离度较小、络合比高的络合物组 成的测定
等摩尔连续变化法测络合比
M + nR = MRn CM+ CR = 常数 CM / C 从 0 →1
在特定波长测定：R不吸收 A CM / C =0.5 ，n = 1 CM / C =0.33 ，n = 2 0
20
0.7
60
0.2
80
0.1
T% A
吸光光度法的测量误差
当dT = 1%时，为了使测量误差 < 5%，控制溶液的 透光率 T = 15 ~ 70 % T = 15 ~ 70 % A = 0.15 ~ 0.80
10
dc/c 8 (%)
6 4 2 0 0 20
dT=2% dT=1%
dT=0.1%
40 60 80 100
d cx cx
dT Tx ln Tx
示差法
Ac bc x lg Tr
Ix Tr Is
∴ Tr > Tx
有
∵ I 0 > Is
d c x cx
dcx cx
结论：示差法提高了准确度
示差法提高准确度的实质
常规法（以水作参比）：溶液s和溶液x的T为0.05和0.10。 T
0 5 10 50 100
单色器
吸收池
检测器
显示
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
分光光度计的构成
光源 单色器
氢灯，氘灯，185 ~ 350 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm.
基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅
③ 选择适当的参比溶液
作用： 消除由于比色皿壁或试剂对入射光的反射或 吸收而带来的误差。
§11.5 吸光光度分析方法
一、经典光度分析方法
1、校准曲线法
单组分的测定
纯物质或共存物质不干扰 A
Lambert-Beer定律
A Kbc
Cx C
一、经典光度分析方法 2、示差光度法
常规法
示差法 A A′ 单组分的测定
吸光物质对光的吸收具有加和性
A A1 A2 An
§11.2 吸光光度法的仪器
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计 分光光度法与分光光度计
可见光分光光度计
紫外分光光度计 红外分光光度计
目视比色法
观察方向 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 标准系列
T(%)
测量条件的选择
① 测量波长的选择： “最大吸收，最小干扰” 即无干扰，选λmax作为入射光波长；有干扰，选灵 敏度较低但能避免干扰的入射光波长。 ② 吸光度范围的选择 ： A = 0.15 ~ 0.80
A = kbc ，k定，只有通过改变b或c来改变A：对已显 色的待测液，可改变b；未显色的，可改变c。
dT-透光率读数误差
dT dT dc2 c dc3
dT dc Er c T lnT
三、吸光光度法的测量误差
Er 10 8 6 T = 0.368 = 36.8 % A = 0.434 误差最小 2 0 4 (36.8) 40 0.4 0.434
c 0.434T Er c T lg T ( T 0.01)
二、双波长分光光度法
存在问题： 1、共存组分与被测组分的吸收谱带重叠 2、溶剂、胶体、悬浮体等散射或吸收辐射 引起的背景干扰 解决方法：双波长分光光度法
双波长分光光度法
原理：双波长分光光度法只用一个试样池。检测器显示的是 试液对两束波长光的吸光度差值△A。
单色器
光 源
1
检测器
单色器
2
切 光 器
I 参比 I0 A lg lg I I 试液
一、测量波长和参比溶液的选择
2、参比液的选择
以显色反应为例进行讨论 M + R 若欲测 M-R 的吸收 max
待测物质的试液 显色剂 溶剂 吸光物质
= M-R max
参比液组成
无吸收 基质吸收 无吸收 基质吸收
无吸收 无吸收 吸收 吸收
光 学 透 明
Y 的存在不干扰 X 的测定
波长组合的选择
1、等吸收点选择参比波长和测量波长。
等吸收点：干扰组分在所选的两波长处具有相同的吸光度
2、选择参比波长和测量波长应使被测组分在这两波 长处具有较大的吸光度差。
§11.6 吸光光度法的应用
一、定量分析
无机离子分析 金属离子的测定— 邻二氮菲光度法测定铁含量 生化物质分析 测定人体的生化指标— 人血清中总蛋白质的测定
It T I0
Lambert-Beer定律物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均 匀非散射的吸收物质，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸光介 质厚度b成正比。
c= mol· L-1 K→ κ 摩尔吸光系数
A bc
mol–1 · cm-1 单位为：L ·
物理意义：当吸光物质摩尔浓度为1 mol· L-1 ，吸光介质 为1cm时，吸光物质度在某波长的吸光度。
吸收 吸收 吸收 吸收
溶剂 不加显色剂的试液 显色剂 显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂
二、比尔定律的偏离
标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标准曲线常发生弯曲（尤其 当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。
引起偏离朗伯-比耳定律的因素：
物理因素 化学因素 介 质 不 均 匀 引 起 的 偏 离 溶 液 浓 度 过 高 引 起 的 偏 离 化 学 反 应 引 起 的 偏 离
A
2、 pH2﹤pKa -2 3、 pH3 ﹥ pKa+2 将(2), (3)代入(1) 得：
[ H ]c HB [ H ] K a
B
kac
[ H ] K a
(1) (2) (3)
AHB＝κHB· c； AB- ＝κB-· c
pKa pH lg
A AB AHB A
样品池 检测器
作用：用于盛待测及参比溶液 玻璃，光学玻璃，石英 厚度（光程）：0.5、1、2、3cm
作用：利用光电效应，将光能转换成电流讯号并放大
光电管，光电倍增管，光导摄像管
信号显示系统
作用：把放大的信号以适当方式显示或记录下来 表头、记录仪、屏幕、数字显示
§11.3 显色反应及其影响因素
显色反应
未知样品
方法简便
光电比色法
利用光电池或光电管等光电转换元件作检测器，来测量通过有 色溶液后透射光的强度，从而求出被测物质含量的方法叫做 光电比色法。
通过滤光片得一窄范围的光(20～50nm) 光电比色计结构示意图
一、分光光度计的组成
分光光度计的组成部件及 其各部分的作用？
0.575
光源 参比 I0
Tx Ts 示差法 T
0 5 10 50 100
（以溶液s作参比）：溶液x的T为0.50
Tr
Ts
落在测量误差较小的范围
结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度
例：某有色溶液以试剂空白做参比，用1cm吸收池于最大 吸收波长处测得A=1.120，已知有色溶液的λ=2.5×104 L· mol-1· cm-1。若用示差法测定上述溶液时，使其测量 误差最小，则参比溶液的浓度为多少？ （示差法使用吸收池亦为1cm厚）
吸收曲线（吸收光谱）
以不同波长的单色光一次照射某一吸光物质，并测量该物质在每一 波长处对光吸收程度的大小（吸光度），以波长（λ）为横坐标，吸光度 （A）为纵坐标，可以得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸光曲线。
定性分析基础
定量分析基础
二、Lambert-Beer定律
A lg T Kbc
0.33 0.5
1.0 CM / CM+ CR
适用于络合比低、稳定性较高的络合物组成的测定
条件稳定常数的测定
A0 A A′
由于络合物离解引 起 A′< A0 解离度
A0 A A0
0
0.5
'
1.0 CM / C
条件稳定常数的测定
MR = 总浓度 c cα cα R + M
平衡浓度 c(1-α)
一、经典光度分析方法 3. 解联立方程法-----多组分的测定 吸光度的加合性
多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸 光度具有加合性，即
A Ai i bci b i ci
i i i
根据加合性原则
有x，y两种物质分别选取各组分的λmax为测量波长λ1 和λ2
A
X1 X2 Y2 Y1 1 2
摩尔吸光系数与质量吸光系数的关系： M S 桑德尔灵敏度S
Ma
二、 Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律成立的前提：
1. 入射光为平行单色光且垂直入射
2. 吸光物质为均匀非散射体系
3. 吸光物质间无相互作用 4. 辐射与吸光物质间的作用仅限于光的吸收过程，无 荧光和光化学现象发生
第十一章 吸光光度法
§1 §2 §3 §4 §5 §6 吸收光度法基本原理 吸光光度法的仪器 显色反应及其影响因素 吸光度的测量及误差控制 吸光光度分析方法 吸光光度法的应用
§11.1 吸光光度法基本原理
一、物质对光的选择吸收
选择性吸收的本质：不同的物质微粒因结构不同而具有不同的
量子化能力，能量差也不同，所以对光的吸收波长也不同。
狭 缝
吸 收 池
双波长分光光度法
双波长分光光度法——波长选择 X Y
设：波长λ1和λ2为的两束 单色光的强度相等
A
A 1 1bc Ab 1 A 2 2bc Ab 2
1 Ab1和Ab2分别表示背景或者干扰物的吸收 2
A (1 2 ) bc
非 单 色 光 引 起 的 偏 离
非 平 行 入 射 光 引 起 的 偏 离
三、吸光光度法的测量误差
仪器测量误差
A bc lg T 0.434 ln T
根据误差传递公式， 可以推导出浓度测量 的相对误差为
T% 100 80 60 40 20 0 dc 1
dc3 dc1 dc2 > < c1 c2 c3
以空白溶剂为参比 以浓度为 Cs 的 标准溶液为参比
I0 Ax lg bc x Ix Ax As Ax
b(c x cs )
△Cx
（Cx > Cs）
△C
c x c x cs
适宜 高 浓度的测定
bc x
示差法的误差
方法 定量原理 相对误差
常规法
Ix Tx I0
1、测量波长的选择—最大吸收原则
无干扰，选择max A 试剂 A 有干扰—吸收最大， 干扰最小。
络合物
络合物 试剂
515
655
415
500
一、测量波长和参比溶液的选择
2、参比液的选择
原则：扣除非待测组分的吸收 A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池） A （参比） = A （干扰）+ A （池）
c(1 ) (1 ) K 2 2 c c 2
A1
x A 1
x
y A1
y A 2
x y bc bcy 1 x 1
A 2 A 2
bcx bcy
x 2 y 2
κ为物质的特征参数，
可通过配制标准溶液测得。
解联立方程，可求得Cx，Cy
例：以分光光度法测定某合金钢中的锰和铬。称取 1.000g钢样，溶解后稀释至50.00mL。将其中的Cr氧化 成Cr2O72-，Mn氧化成MnO4-。然后在440nm和545nm 用1.0cm吸收池测量吸光度列于下表。求此合金钢中锰 和铬的质量分数。(MMn=54.94，MCr=52.00) A 440nm 545nm 0.204 0.860 КMn 95.0 2.35×103 КCr 369.0 11.0
二、物理化学常数的测定
1、弱酸弱碱解离常数的测定
2、络合物组成及稳定常数的测定
1.弱酸弱碱离解常数的测定
A HB B
HB
HB
H＋＋B
B HB B
Ka＝[H+][B]/[HB]
配制三种pH不同, c相同的溶液,测A(b=1). 1、 pH1≈pKa
A AHB AB HB [HB ] B [B ]
没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有 色化合物再测定－－ 显色反应
【类型】 氧化还原和络合反应 （M + nR = MRn ） 影响显色反应的因素
酸度的影响 显色剂的用量 温度的选择 时间的选择 有机溶剂和表面活性剂 共存离子的干扰
§11.4 吸光度的测量及误差控制
一、测量波长和参比溶液的选择
2.络合物的组成及稳定常数的测定 摩尔比法测络合比
M + nR = MRn
CM固定； CMRn CR从 0 开始增大 A
CR
n
CR/CM
适用于解离度较小、络合比高的络合物组 成的测定
等摩尔连续变化法测络合比
M + nR = MRn CM+ CR = 常数 CM / C 从 0 →1
在特定波长测定：R不吸收 A CM / C =0.5 ，n = 1 CM / C =0.33 ，n = 2 0
20
0.7
60
0.2
80
0.1
T% A
吸光光度法的测量误差
当dT = 1%时，为了使测量误差 < 5%，控制溶液的 透光率 T = 15 ~ 70 % T = 15 ~ 70 % A = 0.15 ~ 0.80
10
dc/c 8 (%)
6 4 2 0 0 20
dT=2% dT=1%
dT=0.1%
40 60 80 100
d cx cx
dT Tx ln Tx
示差法
Ac bc x lg Tr
Ix Tr Is
∴ Tr > Tx
有
∵ I 0 > Is
d c x cx
dcx cx
结论：示差法提高了准确度
示差法提高准确度的实质
常规法（以水作参比）：溶液s和溶液x的T为0.05和0.10。 T
0 5 10 50 100
单色器
吸收池
检测器
显示
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
分光光度计的构成
光源 单色器
氢灯，氘灯，185 ~ 350 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm.
基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅
③ 选择适当的参比溶液
作用： 消除由于比色皿壁或试剂对入射光的反射或 吸收而带来的误差。
§11.5 吸光光度分析方法
一、经典光度分析方法
1、校准曲线法
单组分的测定
纯物质或共存物质不干扰 A
Lambert-Beer定律
A Kbc
Cx C
一、经典光度分析方法 2、示差光度法
常规法
示差法 A A′ 单组分的测定
吸光物质对光的吸收具有加和性
A A1 A2 An
§11.2 吸光光度法的仪器
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计 分光光度法与分光光度计
可见光分光光度计
紫外分光光度计 红外分光光度计
目视比色法
观察方向 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 标准系列
T(%)
测量条件的选择
① 测量波长的选择： “最大吸收，最小干扰” 即无干扰，选λmax作为入射光波长；有干扰，选灵 敏度较低但能避免干扰的入射光波长。 ② 吸光度范围的选择 ： A = 0.15 ~ 0.80
A = kbc ，k定，只有通过改变b或c来改变A：对已显 色的待测液，可改变b；未显色的，可改变c。
dT-透光率读数误差
dT dT dc2 c dc3
dT dc Er c T lnT
三、吸光光度法的测量误差
Er 10 8 6 T = 0.368 = 36.8 % A = 0.434 误差最小 2 0 4 (36.8) 40 0.4 0.434
c 0.434T Er c T lg T ( T 0.01)
二、双波长分光光度法
存在问题： 1、共存组分与被测组分的吸收谱带重叠 2、溶剂、胶体、悬浮体等散射或吸收辐射 引起的背景干扰 解决方法：双波长分光光度法
双波长分光光度法
原理：双波长分光光度法只用一个试样池。检测器显示的是 试液对两束波长光的吸光度差值△A。
单色器
光 源
1
检测器
单色器
2
切 光 器
I 参比 I0 A lg lg I I 试液
一、测量波长和参比溶液的选择
2、参比液的选择
以显色反应为例进行讨论 M + R 若欲测 M-R 的吸收 max
待测物质的试液 显色剂 溶剂 吸光物质
= M-R max
参比液组成
无吸收 基质吸收 无吸收 基质吸收
无吸收 无吸收 吸收 吸收
光 学 透 明
Y 的存在不干扰 X 的测定
波长组合的选择
1、等吸收点选择参比波长和测量波长。
等吸收点：干扰组分在所选的两波长处具有相同的吸光度
2、选择参比波长和测量波长应使被测组分在这两波 长处具有较大的吸光度差。
§11.6 吸光光度法的应用
一、定量分析
无机离子分析 金属离子的测定— 邻二氮菲光度法测定铁含量 生化物质分析 测定人体的生化指标— 人血清中总蛋白质的测定
It T I0
Lambert-Beer定律物理意义：当一束平行单色光垂直通过某一均 匀非散射的吸收物质，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸光介 质厚度b成正比。
c= mol· L-1 K→ κ 摩尔吸光系数
A bc
mol–1 · cm-1 单位为：L ·
物理意义：当吸光物质摩尔浓度为1 mol· L-1 ，吸光介质 为1cm时，吸光物质度在某波长的吸光度。
吸收 吸收 吸收 吸收
溶剂 不加显色剂的试液 显色剂 显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂
二、比尔定律的偏离
标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现：标准曲线常发生弯曲（尤其 当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。
引起偏离朗伯-比耳定律的因素：
物理因素 化学因素 介 质 不 均 匀 引 起 的 偏 离 溶 液 浓 度 过 高 引 起 的 偏 离 化 学 反 应 引 起 的 偏 离
A
2、 pH2﹤pKa -2 3、 pH3 ﹥ pKa+2 将(2), (3)代入(1) 得：
[ H ]c HB [ H ] K a
B
kac
[ H ] K a
(1) (2) (3)
AHB＝κHB· c； AB- ＝κB-· c
pKa pH lg
A AB AHB A
样品池 检测器
作用：用于盛待测及参比溶液 玻璃，光学玻璃，石英 厚度（光程）：0.5、1、2、3cm
作用：利用光电效应，将光能转换成电流讯号并放大
光电管，光电倍增管，光导摄像管
信号显示系统
作用：把放大的信号以适当方式显示或记录下来 表头、记录仪、屏幕、数字显示
§11.3 显色反应及其影响因素
显色反应
未知样品
方法简便
光电比色法
利用光电池或光电管等光电转换元件作检测器，来测量通过有 色溶液后透射光的强度，从而求出被测物质含量的方法叫做 光电比色法。
通过滤光片得一窄范围的光(20～50nm) 光电比色计结构示意图
一、分光光度计的组成
分光光度计的组成部件及 其各部分的作用？
0.575
光源 参比 I0
Tx Ts 示差法 T
0 5 10 50 100
（以溶液s作参比）：溶液x的T为0.50
Tr
Ts
落在测量误差较小的范围
结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度
例：某有色溶液以试剂空白做参比，用1cm吸收池于最大 吸收波长处测得A=1.120，已知有色溶液的λ=2.5×104 L· mol-1· cm-1。若用示差法测定上述溶液时，使其测量 误差最小，则参比溶液的浓度为多少？ （示差法使用吸收池亦为1cm厚）
吸收曲线（吸收光谱）
以不同波长的单色光一次照射某一吸光物质，并测量该物质在每一 波长处对光吸收程度的大小（吸光度），以波长（λ）为横坐标，吸光度 （A）为纵坐标，可以得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸光曲线。
定性分析基础
定量分析基础
二、Lambert-Beer定律
A lg T Kbc
0.33 0.5
1.0 CM / CM+ CR
适用于络合比低、稳定性较高的络合物组成的测定
条件稳定常数的测定
A0 A A′
由于络合物离解引 起 A′< A0 解离度
A0 A A0
0
0.5
'
1.0 CM / C
条件稳定常数的测定
MR = 总浓度 c cα cα R + M
平衡浓度 c(1-α)
一、经典光度分析方法 3. 解联立方程法-----多组分的测定 吸光度的加合性
多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸 光度具有加合性，即
A Ai i bci b i ci
i i i
根据加合性原则
有x，y两种物质分别选取各组分的λmax为测量波长λ1 和λ2
A
X1 X2 Y2 Y1 1 2
摩尔吸光系数与质量吸光系数的关系： M S 桑德尔灵敏度S
Ma
二、 Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律成立的前提：
1. 入射光为平行单色光且垂直入射
2. 吸光物质为均匀非散射体系
3. 吸光物质间无相互作用 4. 辐射与吸光物质间的作用仅限于光的吸收过程，无 荧光和光化学现象发生
第十一章 吸光光度法
§1 §2 §3 §4 §5 §6 吸收光度法基本原理 吸光光度法的仪器 显色反应及其影响因素 吸光度的测量及误差控制 吸光光度分析方法 吸光光度法的应用
§11.1 吸光光度法基本原理
一、物质对光的选择吸收
选择性吸收的本质：不同的物质微粒因结构不同而具有不同的
量子化能力，能量差也不同，所以对光的吸收波长也不同。
狭 缝
吸 收 池
双波长分光光度法
双波长分光光度法——波长选择 X Y
设：波长λ1和λ2为的两束 单色光的强度相等
A
A 1 1bc Ab 1 A 2 2bc Ab 2
1 Ab1和Ab2分别表示背景或者干扰物的吸收 2
A (1 2 ) bc
非 单 色 光 引 起 的 偏 离
非 平 行 入 射 光 引 起 的 偏 离
三、吸光光度法的测量误差
仪器测量误差
A bc lg T 0.434 ln T
根据误差传递公式， 可以推导出浓度测量 的相对误差为
T% 100 80 60 40 20 0 dc 1
dc3 dc1 dc2 > < c1 c2 c3
以空白溶剂为参比 以浓度为 Cs 的 标准溶液为参比
I0 Ax lg bc x Ix Ax As Ax
b(c x cs )
△Cx
（Cx > Cs）
△C
c x c x cs
适宜 高 浓度的测定
bc x
示差法的误差
方法 定量原理 相对误差
常规法
Ix Tx I0
1、测量波长的选择—最大吸收原则
无干扰，选择max A 试剂 A 有干扰—吸收最大， 干扰最小。
络合物
络合物 试剂
515
655
415
500
一、测量波长和参比溶液的选择
2、参比液的选择
原则：扣除非待测组分的吸收 A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池） A （参比） = A （干扰）+ A （池）