Western Blot实验步骤及关键分析

【分享】个人整理Western Blot！！！

1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.

6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。

7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。PH8.3

9、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(临用前加)，加水至总量1L。

10、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

11、脱脂奶粉5%(w/v)。

12、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液：

分离胶12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml

超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml

30%丙烯酰胺溶液2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml

pH8.8、1.5mol/LTris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml

10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml

TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml

10%过硫酸铵0.05ml 0.1 ml 0.15 ml

浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml

超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml

30%丙烯酰胺溶液0.3 ml 0.6 ml 1.0 ml

pH6.8、1.0mol/LTris溶液0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml

10%SDS 0.02 ml 0.04 ml 0.06 ml

TEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml

10%过硫酸铵0.02ml 0.04ml 0.06ml

一.配胶

1. 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2. 分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟)，加入10%AP(0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100)及TEMED(分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000)即可

3. 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度<10%时可用0.1%的SDS 封，浓度>10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡

进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正;若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

二.样品处理

1.培养的细胞(定性)：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

⑶100℃，1min。

⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。

⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

⑹待样品恢复到室温后上样。

2.培养的细胞(定量)：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声(100~200w)3s，2次。

⑷12000g离心，4℃，2min。

⑸取少量上清进行定量。

⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

3.组织：

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg 加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。