SDS-PAGE快速染色脱色方法

在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题：

1．如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。（2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。

2．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量25,000—200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.000—70,000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,000—50,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。

可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率，详见后）最好在0.2—0.8之间均匀分布。

在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

3．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。

2．试剂：

（1）标准蛋白质

目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。

②低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产（表16-2）。表16-2 5种标准蛋白质

蛋白质名称Mr

磷酸化酶B

牛血清蛋白

肌动蛋白

磷酸酐酶

烟草花叶病毒外壳蛋白94 000

67 000

43 000

30 000

17 500

每种蛋白含量为40μg。用时加入200μl样品溶解，经处理后，上样10μl（2μg）就能显示出清晰的条带。

③自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择3—5种蛋白质，如马心细胞色素C（Mr12 500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25 000）、猪胃胃蛋白酶（Mr35 000）、鸡卵卵清蛋白（Mr43 000）、牛血

清白蛋白（Mr67 000）等蛋白质，按照每种蛋白0.5—1mg•ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。

（2）不连续体系SDS-PAGE有关试剂

①10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

②1%TEMED（V/V）：取1mLTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

③10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。

④样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol•L-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液。

●先配制0.05mol•L-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再中入约3ml 1mol•L-1 HCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。

●按表16-4配制样品溶解液。

表16-4 不连续体系样品溶解液配制

SDS 巯基乙醇溴酚蓝蔗糖0.05mol•L-1Tris-HCl 加重蒸水至最后总体积为

100mg 0.1ml 2mg 4g 2ml 10ml

*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。

⑤凝胶贮液

●30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

●10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

⑥凝胶缓冲液

●分离胶缓冲液（3.0mol•L-1 pH8.9 Tris-HCl缓冲液）：称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol•L-1 HCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4℃贮存。

●浓缩胶缓冲液（0.5mol•L-1 pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol•L-1 HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4℃贮存。

⑦电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol•L-1 Tris—0.384 mol•L-1甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

⑧1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100ml，加热使其溶解，4℃贮存，备用。（4）固定液

取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。

（5）染色液

称考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。

（6）脱色液

冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。

四、操作步骤：

（一）安装夹心式垂直板电泳槽

关心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图16-4。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个形硅胶框、长与短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成（见图16-5）。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板），下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部间依下列顺序组装：

2、将长、短玻璃板分别插到形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

3、将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

4、将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。

5、竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。其目的