微生物检测

微生物试验检测

设备仪器：

酶标仪、显微镜、恒温培养箱、干燥箱、冰箱、冰柜、恒温水浴锅、离心机、离心沉淀器、微量振荡器、电子天平、生物天平、高压锅、超净工作台、煤气灶、煤气罐、移液器、酒精灯、手术剪、止血钳、镊子等。

实验检测项目：

一、血清学

1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法

2．凝集反应

⑴鸡白痢和鸡伤寒的诊断

⑵鸡霉形体的诊断

3．免疫扩散试验（AGP）操作方法

⑴鸡传染性囊病的诊断

⑵鸡淋巴白血病的诊断

二、孵化厅的微生物学检测

1.种蛋表面的细菌检测

2.绒毛的细菌检测

3.终止胚的细菌检测

4.一日龄雏鸡的健康检测

5.空气中细菌的检测

6.设备表面细菌的检测

7.水样的细菌的检测

三、鸡舍的细菌检测

1.空气中细菌的检测

2.物体表面细菌的检测

3.水样的细菌检测

4.垫料的细菌检测

5.饲料的细菌检测

四、消毒剂及其使用效果的测定

五、细菌对药物的敏感性试验

检测流程

一、血清学

1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法

1.1 红细胞凝集试验（HA）

1.1.1 在“V”型微量反应板上进行。每孔加入50微升（用微量进样器或将16号注射针头磨去斜尖，调整针头孔径使每滴恰好25微升）pH 7.2的0.01摩尔／升PBS液或生理盐水，向第1孔滴加新城疫抗原50微升，吸放3～5次混匀，然后从第一孔吸出50微升加入第二孔，以相同方法混匀，再从第二孔吸50微升加入第三孔，如此做倍比稀释至倒数第二孔，再从倒数第二孔吸出50微升弃去，最后一孔不加病毒（抗原）作为红细胞对照。

1.1.2 吸取0.5％鸡红细胞悬浮液，每孔滴加50微升，加毕后在微量振荡器上振荡15～30秒，使其混合均匀，静置室温下或37℃温箱中作用20～40分钟。

1.1.3 当对照孔红细胞全部沉入孔底中间，即可判定各孔的红细胞凝集情况。以病毒最大的稀释度孔出现100％凝集现象者为这个病毒的凝集价，即一个血凝单位。

1.2 血凝抑制（HI）试验

1.2.1 4单位抗原（病毒）的配制如上述血凝试验表中病毒的血凝价为第八孔（256，即1:256倍稀释），4个单位的病毒则除以4，即64倍（64）稀释即可。但实验室一般实际使用的抗原浓度不尽相同，新城疫用8～10单位，禽流感病毒用4单位，支原体用2～4单位。

1.2.2 取洁净的96孔微量反应板，编号后按血凝试验方法给1～11孔各加25微升稀释液，第十二孔加50微升稀释液。

1.2.3 取被检血清或已知阳性血清25微升加入第一孔中，混合均匀，从第一孔吸出25微升加入第二孔，如此作倍比稀释到第十孔，从第十孔吸出25微升弃去，第十一孔不加血清，作为抗原对照，第十二孔不加血清和抗原作为红细胞对照。

1.2.4 给1～11孔各加25微升4单位抗原，振荡混匀，置37℃温箱或室温作用20～30分钟。

1.2.5 加0.5％红细胞悬液，每孔加25微升，置37℃作用20～30分钟观察结果。待第十一孔抗原对照孔的红细胞均匀铺在管壁（100％凝集），检查各孔的抑制情况。

1.3 判定标准和注意事项

1.3.1 判定时首先应检查对照孔是否正确。如正确则证明各种条件及操作无误。

1.3.2 红细胞凝集时，红细胞分散在管底四周呈界限明显的扣状凝集者判为阳性“＋”，无凝集或凝集抑制时，红细胞集于管底呈点状为阴性“－”。有些实验人员建议判定时倾斜血凝板，观察如有“泪滴痕”现象或管底流动现象者判定为阴性。

1.3.3 判定时结果与温度和时间有关。温度高时，结果出现快，需要的时间短，温度低时，结果出现晚，一般需30分钟。

1.4 HA和HI试验在禽病诊断中的应用

1.4.1 用于禽流感、新城疫等病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；（如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。

1.4.2 HI试验可用于发病禽群的诊断鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI试验对食群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和离散性有助于诊断。

2．凝集反应

2.1鸡白痢和鸡伤寒的诊断

2.1.1 材料准备

抗原：鸡白痢禽伤寒多价平板抗原。

标准阳性血清、弱阳性血清、阴性血清。诊断液均由指定单位提供。

白瓷板

移液器

采血针头、酒精棉（75%、95%）

2.1.2 操作程序：

ⅰ．洁净玻璃板打好格，在检测开始前，先作阳性血清和抗原对照试验，用移液器吸取鸡白痢禽伤寒多价抗原液，加入玻璃板三个方格里每格0.05ml,分别加入标准强、弱阳性血清及阴性血清0.05ml，混合均匀，在2—3分钟内，强阳性血清出现100%凝集（+ + + +）；弱阳性血清出现50%（+ +）；阴性血清不凝集（－），方可进行检测工作。

ⅱ．在玻璃板上滴加抗原（0.05ml）用针头刺破鸡肱静脉，待血流出后，用移液器取出（0.05ml）把血液放入抗原液中，以该取血移液器吸头混合均匀，并摊开约2厘米宽度，轻轻摇动反应板，观察结果。

2.1.3 结果判定：

抗原与全血混合后2—3分钟，判定结果，有50%（+ +）以上凝集为阳性，不发生凝集为阴性。

2.1.4全血平板凝集反应判定标准：

ⅰ、出现大块凝集、液体清亮为100%（++++）凝集；

ⅱ、出现明显凝集块、但是液体稍有混浊为75%（+++）凝集；