凝胶层析讲稿6
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座

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东西都是凝胶)。
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三、加样与洗脱
先打开下口开关,放出凝胶柱面上溶液(或吸收, 但溶液面不能低于凝胶表面),然后加样,控制 流速,使样品渗透凝胶内。
本试验样品为:血红蛋白和溴酚蓝混合样品 0.75mL(血红蛋白:溴酚蓝=2:1),用移液管滴加 在液面下(不能冲起凝胶柱,也不能沿管壁流 下),样品下渗至凝胶面时,关闭下口,完成上 样,再加一层洗脱液(3~5cm)。
【目标】
掌握凝胶层析基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分 子试验技能
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【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用含有网状结构凝胶分子筛作用,依 据被分离物质分子大小不一样来进行分离 技术。
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凝胶层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离技术,又称之凝胶过 滤、分子筛层析或排阻 层析。
待分离样品:1。鸡血红蛋白:取新鲜抗凝全血5ml,于 r/min离心10min,弃血浆,用三倍于血球体积 0.9﹪Nacl溶液洗血球(颠倒混匀)。离心弃去上清液, 重复1~2次,至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体 积蒸馏水,混匀,使血球破碎,过滤,即得血红蛋白溶 液。2。 1mg/ml溴酚蓝溶液 (待分离样品老师已准备好) 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 洗脱液:0.2mol/L NaCl缓冲液
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思索题
一、为何溴酚蓝能与血红蛋白在层析柱中能 够很好分开?
二、生化试验中惯用凝胶有哪些?各有何特 征?
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凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质讲课讲稿

琼脂糖凝胶特点
❖室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶,对样品的吸附性很小。
❖洗脱速度较快
❖排阻极限大,分离范围广,适合分离大分 子物质。
小结
❖ 凝胶层析的原理:分子筛效应 ❖ 凝胶层析有效分配系数(Kav):被分
离的化合物被凝胶排阻的程度。 ❖ 层析实验操作过程中的注意事项。 ❖ 实验结果:观察到蓝色蛋白洗脱快,黄
溶质在固定相中的浓度(Cs)
K=
溶质在流动相中的浓度(Cm)
☻K值大:被固定相吸附的牢固,随流动相的移 动速度较慢。
☻若混合物中各组分K值相差较大, 则能较易地分 离,反之,K值相差较小,分离效果差。
离子交换层析(ion exchange chromatography)
用离子交换剂(在惰性载体上引入带有电荷的活性 基团)作固定相,与流动相中离子发生可逆性离子 交换反应而进行分离的方法。
重点1
凝胶层析的原理
分子筛效应
❖ 比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部, 完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动,它们经历的 流程短,流动速度快,首先流出。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部,然后再扩散出来,经历的流程长, 流动速度慢,后流出。
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
❖分离原理 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的
配基,这些配基可以与流动相中溶质分子发 生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude
2. Wash away non bound
sample with the
sample components from
凝胶过滤层析讲解

第二节 凝胶介质的分类和性质
1) 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖(Sephadex) ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2)琼脂糖凝胶 3)聚丙烯酰胺凝胶
(1)葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖(Sephadex)
由葡聚糖(右旋糖酐)和交联剂以醚键交联而成 理化性质 1)型号不同,交联度不同,膨胀度和吸水量不同,筛孔大 小和分级范围也不同; 2)商业用的型号又G10、G15、G25,G100等,数字代 表每g干凝胶吸水量×10,如G50即表示每克干凝胶的吸水 量为5.0毫升; 3)数字越小,分级范围窄,适合低分子量的蛋白质的分离, 数字越大,适合宽范围分子量的分级
几种凝胶的比较
种类(商品名) 商品型号 葡聚糖凝胶 (Sephadex) 琼脂糖凝胶 (Sepharose) G15, G25, G100… 2B, 4B, 6B… 型号中数字意义 每g的吸水量(ml)×10 数字越大,筛孔越大 颗粒中琼脂糖的含量 (%); 数字越大,筛孔越小 排阻限度 6×105 稳定性 水、盐、碱、弱酸 中稳定;对强酸敏感
(2) 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose(瑞典)
1)2B,4B等型号,数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量,数字越大,分离的范围越小 2)与1,3-二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖, 稳定性提高;
Bio-gel A(美国)
一般有A0.5, A1.5等型号,数字×106代表分 离的分子量极限; 与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比,琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好,洗脱速度可以快些
琼脂糖凝胶的优点和缺点
优点 琼脂糖凝胶(agarose gel)比葡聚糖凝 胶和生物胶的排阻范围大,可达相对分子质量 108,使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和 病毒颗粒;机械性能好。 缺点 稳定性较葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶稳定性 差,不耐酸碱,最好将条件控制在pH 4~9 之间,温度0~40℃,超出此范围,可能被破 坏。
生物制药工艺学课件讲稿—凝胶层析

第七章凝胶层析定义:将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相,由于流经体积的差异,使不同分子量的组份得以分离的层析(色谱)方法,又叫扩散层析,排阻层析,分子筛层析第一节基本原理一.分离原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,内部具有网状筛孔,利用球状凝胶内的筛孔,使分子流过填充凝胶的管柱时,大分子无法进入凝胶筛孔,而只流经凝胶及管柱间的孔隙,很快就可以流出管柱,较小的分子因为进入凝胶内的筛孔,故在管柱内的停留时间较长,由此区分大小不同的分子,亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。
一般状况下,凝胶不会吸附成份,所有欲分离物质都会被洗出,这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶层析分离的基本原理如下:凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。
第——部分是全排阻分子,也可称之为上限分子,是不能起筛分作用的大分子。
第二部分是部分渗透分子,称为分离分子,是凝胶介质有效分离的分子。
第三部分是全渗透分子,称之为下限分子,是不能起筛分作用的小分子。
如图2—27所示。
从图2—27可以看出,A—B之间为该凝胶的有效分离范围.可分离相对分子质量范围是103一105,高于相对分子质量为105的是全排阻分子,低于相对分子质量为105的是全渗透分子。
二.参数的表示方法及其意义1.表示方法(1)柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后,所占层析柱内的总体积,称为柱床体积或床体积,以Vt(totle volume)表示,单位为m1。
(2)外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那—部分水相体积或溶剂体积,称之为外水体积或外体积、空隙体积,以Vo(outer volume)表示,单位为ml(3)内水体积是凝胶吸水溶胀后,存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积,称之为内水体积或内体积,以V i(inner volume)表示,单位为ml。
(4)凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积.也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积,称为胶体积或称干胶体积,以Vg(gel volume)表示,单位为ml。
实验6 凝胶层析分离技术—血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

实验6、凝胶层析分离技术——血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离(学生实验方案)一、实验目的1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2. 熟悉凝胶层析的操作过程。
3.掌握蛋白质洗脱分离监测和收集系统的安装及使用技术。
二、实验原理凝胶层析又叫分子筛层析,是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。
当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
本实验用葡聚糖凝胶作支持物,用核黄素(黄色,相对分子质量为267KD)和血红蛋白(红色,相对分子质量为67000KD)混合物作样品,在层析时,血红蛋白相对分子质量大,不能进入凝胶颗粒内部,而从凝胶颗粒间隙流下,所受阻力小,移动速度快,先流出层析柱;核黄素相对分子质量小,可进入凝胶颗粒内部,洗脱流程长,因而所受阻力大,移动速度慢,后流出层析柱。
这样就可分离核黄素和血红蛋白。
三、试剂配制1、葡聚糖凝胶:sephadexG-252、洗脱液(pH7.2,0.1mol/L磷酸盐缓冲液):取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml和0.1mol/L 磷酸二氢钠280ml,混匀。
共配10L。
3、0.2%(m/v)血红蛋白溶液4、0.05%(m/v)核黄素(VitB2)溶液5、样品液:0.05%核黄素(VitB2)与0.2%血红蛋白液等量混合置4o C保存。
注意:核黄素需近期生产,并新鲜配制。
四、主要仪器设备1、恒流泵2、层析柱:高25~40cm,内径1cm。
3、自动收集器4、紫外检测仪5、台式记录仪6、可见分光光度计五、实验步骤1、凝胶处理;(1)溶涨与浮选:称取SephadexG-25 5g,加磷酸盐缓冲液(洗脱液)50ml,置于水中浸泡6小时(沸水浴中为2小时)。
转移至100mL量筒中,再加磷酸盐缓冲液(改用蒸馏水)至100mL刻度,搅动凝胶再静置,待凝胶沉积后,倾去上层细粒悬浮,如此反复多次。
(2)平衡:将浸泡后的凝胶,用3~4倍量的洗脱液处理约1小时,搅拌后继续去除上层细浮悬液。
《凝胶层析法》课件

改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件,提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件,减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质,提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件,提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中,确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部,确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测,观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析,确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果,分析实验 误差和影响因素,总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据,应采用适当的统计方法进行处理和分析, 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失,应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一:分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质,可以获得高纯度的蛋白质样品,为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异,利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离,大 分子不能进入凝胶孔洞,而小分子可以进入凝胶孔洞,从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代,最 初用于蛋白质的分离。
目前,凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高,凝胶层析法逐渐应用于更多 领域,如生物技术、制药、环境科学 等。
凝胶过滤层析

三 操作步骤
1 凝胶的选择和预处理 本实验样品中含有分子量差异不大的多中组 分,其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白 质,因此属大分子化合物的分离纯化,故选 用SephadexG-75。对球形蛋白质而言,其排 阻限为3000-70000。 称取40g SephadexG-75,加入10倍以上吸液 量的蒸馏水浸泡,在水浴加热时充分膨胀。
三 操作步骤
4 样品预处理及加样 蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜,溶剂为洗脱液。 如样品浑浊,应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。 将床面多余的洗脱液除掉,吸至离层析床面2厘米处为止。 将出口打开,使床面的洗脱液流至1毫米,关闭出口。用 加样器将样品加入床表面1厘米左右,再打开出口,使样 品渗入凝胶内。样品加完后,用尽量少的洗脱液洗涤表 面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后,再仔细加入洗脱液 至离床面3-4厘米处,即可接上洗脱瓶进行层析。
实验六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相, 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱, 使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层 析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。 填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的,他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言,如果分子大小合适时,则可以不同程 度地往孔隙中扩散,大分子量的溶质分子只能占有较 小的孔隙,而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外, 还可以占有另外一些起更小的孔隙。
一 实验原理
所以随着溶质分子尺寸的减小,其占有 孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量 分布的高聚物溶液从柱中通过时,由于 溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间 进行扩散分配的差异造成较小的分子在 柱中停留的时间比大分子停留的时间要 长,所以整个样品按分子大小顺序而分 开,最先洗脱出来是最大的分子。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT讲稿

• 制备:
• 将干胶颗粒悬浮于5 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液
中
• 充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
3. 凝胶装柱
• ①柱固定于架子上,垂直放置,关住出口 • ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液,使G-50 开始下沉, • 至1 ~2cm时,打开出口 • ③凝胶逐层上升,至顶部 2-3cm时,关闭出口
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内,使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法,包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法,包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
(3)层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
注意点:
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
• 放置一段时间,约40分钟(使凝胶更好的压实)
注意:
防止床面干涸,可适当补充蒸馏水
5. 加样
• ① 加样前打开出口,使床面的蒸馏水流出,正好
露
• 出床面时,立即关闭出口(将干未干) • ② 用滴管将混合样品(0.6ml,即血红蛋白和溶菌酶 • 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 • ③ 打开出口,使样品进入床内,直到床面重新露
出,
• 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时,反复多次加入蒸
•
馏水,进行洗脱,直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置,待Hb洗脱完后,
•
用试管分步收集洗脱液
• ③ 10d/管,每管加NaOH 2d,CuSO4 2d • ④ 检查溶菌酶洗脱情况,若为紫色,则为(+)
《凝胶层析技术》课件

将过滤后的样品加入层析柱中,确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液,如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求,调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性,使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质,通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质,将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质,如盐、DNA、 RNA等,提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析,通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度,计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求,凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件,以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展,凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合,以及在微流控芯片上的集成应用,以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步,凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率,减少人为误差,还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程,可 以实现更高流速下的高效分离,缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后,用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱,去 除残留的杂质和洗脱液。
《凝胶过滤层析》课件

高分子材料
随着高分子合成技术的进步,新型的高分子材料将应用于凝胶过滤层析中,以提高分离效率和分辨率。
纳米材料
纳米材料具有独特的物理和化学性质,将其应用于凝胶过滤层析中,有望实现更高效的分离和更精确的检测。
自动化和智能化发展
借助人工智能和机器学习技术,对凝胶过滤层析的数据进行深度分析,为实验结果提供更准确的解释和预测。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚合形成的网状高分子凝胶,具有良好的分子筛效应。
简介
应用
优点
缺点
常用于分离蛋白质、多肽等生物小分子,也可用于制备亲和层析介质。
分离效果好、分辨率高、操作简便。
可能产生毒性,对盐浓度和pH值敏感。
凝胶过滤层析的步骤
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葡聚糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖单元组成的线性高分子凝胶,具有良好的化学稳定性和生物相容性。 分离效果好、分辨率高、操作简便。 广泛用于分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子,也可用于制备亲和层析介质。 成本较高,对盐浓度和pH值敏感。
琼脂糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的线性高分子凝胶,具有较好的机械强度和稳定性。 常用于分离DNA、RNA和蛋白质等生物大分子,也可用于制备微孔过滤介质。 机械强度高、稳定性好、成本较低。 对盐浓度和pH值敏感,可能产生拖尾现象。
凝胶过滤层析是一种基于分子大小分离蛋白质混合物的技术。
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定义
它利用具有不同孔径的凝胶作为分离介质,根据蛋白质分子的大小和形状进行分离。
第五章-凝胶过滤层析PPT优秀课件

每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围,分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围,可以将溶质分子分为三类: 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子,它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外,从颗粒间隙中通过,所受阻 力最小,流程也最短,首先从层析柱中被洗脱下来;
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
(1)蛋白质混合物上柱; (2)开始洗脱,小分子进入凝胶颗粒内,大分子被排阻在
颗粒外; (3)小分子被滞留而移动慢,大分子移动快,大小不同的
分子开始分开; (4)大小不同的分子完全分开; (5)大分子已被洗脱,而小分子仍在层析柱内。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间,不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括: 总柱床体积(total volume, Vt),是凝胶经溶胀、装柱、
沉降,体积稳定后所占据层析柱内的总体积; 外水体积(outer volume, V0),是柱中凝胶颗粒间隙的液
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子,它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部,洗脱时所受阻力最大,流程也 最长,最后从层析柱中被洗脱; 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子,它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的,是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限,或者 均小于分级范围下限,它们就无法通过层析而分离。
6.3凝胶层析分离技术

按操作技术4的方法,将1mL标准蛋白质混合液上柱,然 后用0.025mol/L氯化钾-0.2mol/L乙酸溶液洗脱。流 速3mL/10min,3mL/管。用核酸蛋白质检测仪280nm处 检测,用部分收集器收集,记录洗脱曲线,或收集后用 紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸收值。 以管号(或洗脱体积)为横坐标,光吸收值为纵坐标作出 洗脱曲线。 根据洗脱峰位置,量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve) , 以蛋白质分子量的对数1gMr,为纵坐标,Ve为横坐标, 作出标准曲线。 根据已测出的Vo和Vi以及Vt,分别求出Kd和Kav
葡聚糖凝胶部分结构
(Sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构
(Bio-Gel P)
琼脂糖凝胶的部分结构
琼脂糖凝胶(Sepharose)
(Sepharose)
第二节
基
本
原
理
一、凝胶的结构与分子筛效应 二、凝胶床总体积 三、分配系数(Kd) 四、有效分配系数(Kav) 五、分子量与Ve 的关系
洗脱液的选择
控制凝胶收缩
影响洗脱的因素
流速对蛋白质分辨率的影响 操作压与流速的关系
流速对蛋白质分辨率的影响
黏 度 对 分 辨 率 的 影 响
黏度对分辨率的影响
凝胶柱层析操作压
操作压与流速的关系
加样量对分辨率的影响
I .加养量少时,
A、B二种物质充全 分开。 II.加养量适当 时,A、B 二种物 质刚刚分开。 III.加养量太大 时,A、B二种物质 只能部分分开。
一、凝胶的选择与处理
二、凝胶装拄制备 三、样品上柱及洗脱 四、实验操作 五、凝胶柱的保养和凝胶的保存
第七章 凝胶层析

凝胶层析操作
样品和加样
• 样品:浓度、粘度、样品量 • 加样:直接加样;不同比重液体
洗脱与收集
• 操作压 • 洗脱剂:水、缓冲液、有机溶剂 • 流速
五 凝胶层析的某些扩展
上行凝胶层析
• 上行凝胶 • 反转柱
增加有效床高
• 串联层析 量分析、简单方便、分辨率高、多个样品、 • 应用
第二节 凝胶的结构和性质
葡聚糖凝胶 • 结构 : 单体,交连剂(3-氯-1,2环氧丙 单体,交连剂(3 烷) • 规格和型号:SephadexG ,型号 规格和型号:SephadexG ,型号 • 性质:不耐强酸、碱、氧化剂,耐稀酸、 碱、盐、有机溶剂和高温。 • 保存:
修饰葡聚糖凝胶:
亲脂性葡聚糖凝胶 交联葡聚糖离子交换 剂
聚丙烯酰胺凝胶 • 结构 • 合成:单体、交连剂、催化剂、引发剂 • 特点:化学稳定性高、机械强度好、无非 特异性附 使用保存方便
琼脂糖凝胶
结构:单体,连接,线型分子间以氢 键 交连 特点:无非特异性吸附、化学稳定性 差(pH4差(pH4-9、强度低、对温度敏感 多孔玻璃微球
第三节 凝胶层析的实验条件和 操作
凝胶的选择和处理
• 原则:根据实验目的不同选择不同型号的凝胶 • 凝胶的选择:类分离、分级分离 • 凝胶粒度的选择:大小及是否均匀 • 凝胶的预处理:充分溶胀
凝胶层析柱的设计和制备
层析柱的选择:根据分离目的选择柱长 比、支持物、 凝胶柱的填装:支持物、管壁、气泡、 沟 流、气泡 检查和维修:表观、胶面、操作压
溶液通过色谱柱造成的峰宽
分子扩散——纵向扩散 分子扩散——纵向扩散 涡流扩散——凝胶颗粒障碍 涡流扩散——凝胶颗粒障碍 流动相中传质阻力——径向扩散 流动相中传质阻力——径向扩散 固定相中传质阻力
医学检验凝胶层析终稿

【目的】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白 质的实验技能
【原理】
一、基本原理: 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利
用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照 蛋白质分子量大小进 行分离的技术,又称 之凝胶过滤、分子筛 层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身 象“筛子”。不同类 型凝胶的筛孔的大小 不同。
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内,经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻 在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间向下流动,因此流程较 短,移动速度快;所以首先流出。
• 请问: • 选择哪一种凝胶作为纯化LDL的介质?
血浆脂蛋白的分类、性质及组成
三. 凝胶层析常用术语
• 1. 保留值(Retention Value)是表示样品 中各组分在层析柱中停留时间的长短。或 组分流出时所需流动相体积的多少。它用 来描述层析峰在层析图上的位置。
A保留值tR1ˊ=tR1-tm B保留值tR2ˊ=tR2-tm
此线和上述连线交于3处。从3到峰谷的距离为f, 从3到基线距离为g,•Rs=f/g•若Rs=l,则组分完全分离
•
Rs<l,则组分部分分离
•
Rs→0,组分不能分离,或分离极差
4. 柱效
• 某一组分随流动相经过一定距离后,流动相中某 组分的平均浓度与固定相的平均浓度达到分配平 衡,完成这一平衡所需要的层析柱的柱长称为板
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凝胶过滤法原理:
液相色谱法是分离纯化的一种重要方法,在多肽、蛋白质及天然生物制品的分离纯化工艺中早已获得应用。
近年来随着制药工业、合成化学和生物技术领域新要求的提出,以获取纯产品为目的制备色谱获得蓬勃发展。
制备色谱还在分子生物学中显示出优异的性能,在生物工程下游技术中发挥越来越重要的作用,它已经走出实验室投入到大规模的工业化生产中。
常用的方法有凝胶层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等。
凝胶过滤(gel filtration),又称为凝胶层析(gel chromatography)、分子筛过滤(molecular sieve filtration)等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术,广泛应用于酶、蛋白质、核酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离纯化。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不
同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分
离物质各成分按分子大小分开,达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网
眼里吸满水后,凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半
固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在
凝胶颗粒上有如筛眼,小于筛眼的物质分子均可
通过,大于筛眼的物质分子则不能,故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时,小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼,并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动,从一个颗粒的网眼流出,又进入另一颗粒的网眼,如此连续下去,直到流过整个凝胶柱为止,因而流程长、阻力大、流速慢;大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼,只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动,其流程短、阻力小、流速快,比小分子先流出层析柱;小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子,则居中流出。
这样将分离物质按分子大小的不同分离开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品,主要有交联葡聚糖(商品名为Sephadex)、琼脂糖(商品名为Sepharose)、聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio–gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等。
我们主要学习葡聚糖凝胶。
由于葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈惰性,不与被分离物质发生反应,所以分离的效果较好。
本实验就是通过凝胶层析,首先用浓度为10mg/mL的蓝色葡聚糖-2000测试凝胶柱均匀性,然后分离牛血清白蛋白和氯化钴的混合液。
即在层析柱中加入含有牛血清白蛋白和氯化钴的溶液,在凝胶柱上形成一个暗红色区带,随着时间推移,牛血清白蛋白和氯化钴逐渐分开,牛血清白蛋白和蓝色葡聚糖在前(蓝色区带),氯化钴在后(粉色区带),从而达到分离的目的。
本实验操作简便,直观性强,趣味性浓,通过肉眼观察即可检验分离效果。
目的要求:
1学习和掌握分子筛凝胶层析法的工作原理和基本操作技术,其中包括
以下的柱易发生“管壁效应”,即柱中部分的物质组分移动较快,管壁周围的则移动较慢,造成分离混乱。
当然柱的内径也不宜过粗。
凝胶层析中,在进行小分子物质(MW<1 500),如无机或其他物质与大分子物质(MW<20 000)分离时,层析柱的体积一般约为样品的4–10倍,高度与直径的比例为5:1至15:1之间,这类柱也称为“脱盐”柱,常用网孔很小的凝胶如G–25。
用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱,体积应为样品体积的25~100倍。
柱长度与直径的比例为20:1~100:1。
装柱的操作过程如下:将层析柱垂直固定在支架上,打开柱下口开关。
将溶胀好并脱气后的凝胶放在烧杯中,用玻璃棒搅匀凝胶液,顺玻璃棒灌入柱内。
此时柱下口一边排水,上口一边加入搅匀的凝胶,可见凝胶连续均匀地沉降逐步形成凝胶柱。
当到达所需凝胶柱高度时,立即关闭下口,待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。
凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm,并覆盖一层溶液。
灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度,不能时断时续,否则将出现分层或“纹路”等毛病。
若中途出现这些现象,可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起直至出毛病的部分,再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。
若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时,要重新装柱,以免影响层析效果。
在做大型的凝胶柱时,灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。
所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖-2 000 (Blue dextran–2 000)通过凝胶柱,观察形成的色带是否整齐,若色带歪斜,应该重新装柱,直至达到要求。
刚从冰箱中取出的凝胶液,不能马上用来灌柱,应平衡至室温后再用,不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。
在整个灌注凝胶的过程及使用中,凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液,以免进入空气。
若进空气再加入溶液时,凝胶柱中易形成气泡。
(3)平衡
装好的凝胶柱,使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱,以压实凝胶,这个过程称为平衡。
(4)上样
将样品加入到凝胶柱中,准备层析的过程称上样。
上样时,应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。
这三个因素会影响到以后的层析效果。
一般来说“脱盐”层析时,上样体积可为柱体积的10%~25%;生物大分子的分级分离,约为柱体积的1%~5%。
样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上,不然洗脱峰会变宽和歪斜。
离子强度要达到0.08,以免产生特异性吸附。
上样操作:先打开层析柱的下口开关,放出凝胶柱面上的溶液,或用胶头吸管吸取,使液面与凝胶表面相平齐,但切忌液面低于凝胶表面。
然后将样品均匀地加在凝胶表面,打开柱下口开关,控制流速,使样品慢慢渗入凝胶内。
加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面,也不能沿管壁流下,以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。
当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时,关闭下口,完成上样。
然后在凝胶柱面上加一层(3~5cm)洗脱液,接上洗脱瓶准备洗脱。
(5)洗脱
用规定的溶液流过样品,使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱,所用的溶液称为洗脱液。
洗脱液放在贮液瓶(洗脱瓶)中并与层析柱相通连。
洗脱时只要打开层析柱下口开关,洗脱液即可流出。
洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。
因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会,流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出;过慢时已分离的分子会因扩散而混合。
因而要保持适当的恒定流速。
洗脱液的流速取决于它的静水压。
静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力(或接触空气的两个液面间的高差),这个高度差越大,静水压越大,洗脱液的流速就越快。
这个压力差可以调动,如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减;或者降低或提高层析柱出口的位置等,因此静水压又称操作压。
在凝胶层析中,不仅要保持静水压的恒定,还要保持适当的静水压。
这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形,对静水压仅有一定的承受能力,不同软胶的承受能力也不相同,静水压超过凝胶的承受能力时,最初流速会很快;其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧,流速逐渐降低,最后甚至流不出。
所以,保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。
脱盐一般使用的是G–25属于硬胶,硬胶不易变形,受静水压的影响较小,实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5mL/min左右,随着洗脱液的流出,样品逐步被分开。
用试管收集洗脱液,按顺序每管收集2mL。
(6)检测
每管加水1mL,稀释1倍(或不稀释),用分光光度计测定其光密度值。
红色溶液部分在520nm处测定,蓝色溶液部分在280nm处测定。
以光密度值为纵坐标,管数作横坐标,绘制出洗脱曲线。
(7)凝胶的洗涤及保存
由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用,所以无需“再生”,只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。
但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧,流速将减慢,所以使用一段时间后应倒出来,清洗后重新装柱。
凝胶暂时不使用可浸泡在20%乙醇溶液中,存放在4℃冰箱中。
若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠(NaN3)或0.01%乙酸汞等防腐剂,以防发霉。
用时以水洗去防腐剂即可使用。
问题:(第五题必答,然后再任选两道题答)
1.利用分子筛凝胶柱层析法分离混合样品时,怎样才能得到较好的分离效果?
2.在分离已知分子量的蛋白质时,如何选用凝胶?
3.为什么要采用凝胶层析作为分离蛋白质的方法?
4.在选择色谱柱时应该注意些什么?
5.根据所得到的实验数据进行分析和讨论。