转基因原理

转基因原理、GMO检测原理及生物安全评价

摘要从技术原理和方法进展着手，综述了植物转基因的不同方法。植物基因转化方法主要包括载体介导的转化和直接基因转移，着重阐述了植物转基因方法的机制以及各种方法的适用范围、应用实例和进展；比较了相互的优缺点。并讨论了GMO 生物安全评价的主要内容、常用的检测方法和近年来国内外有关生物安全问题的研究进展。

关键词植物转基因；载体介导法；直接导入法；GMO；生物安全；检测方法

Abstract In the thesis，the different measures of piant gene transformation were summarized according to the technoiogy principie and method deveiopment，especiaiiy in expatiating the mechanism and appiicabie range of the methods，providing some exampies in appiication and deveiopment，and its advantage and disadvantage.And discussed GMO biological safety evaluation main content of commonly used detection methods and the recent research progress on biological safety of.

早在20 世纪70 年代，人们就开始探索植物转基因研究。1970 年，Morton 等人关于钙盐处理大肠杆菌即能吸收外来DNA 的发现，奠定了磷酸钙诱导外源基因的高效转化。近几十年，随着高等植物的细胞培养、组织分化和再生，以及基因重组技术发展日趋成熟，植物转基因技术应运而生。而随着现代生物技术的迅速发展,生物安全问题逐渐成为国际社会关注的热点问题之一。

一、植物转基因技术和方法概述

1 载体介导法

1.1 农杆菌介导法农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。它是利用根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）的T（i Tumer induce）质粒和发根农杆菌（Agrobaterium rhizogenis）的R（i Root induce）质粒上的1 段T- DNA 区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T - DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。

1.2 病毒介导法病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体。植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有3 种：t单链RNA 植物病毒载体系统，是以单链RNA 为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA，将其克隆到质粒或粘粒载体上，把外源基因插入到病毒的cDNA部分，通过体外转录，将带有外源基因的病毒DNA 感染并进入植物寄主细胞。Kozicl 和Siegal 于1984 年首先应用

烟草脆裂病毒（TRV）这种病毒载体系统。随后，研究比较充分的雀麦花叶病毒（BMV）。有报道将人）- 干扰素克隆到BMV 的RNA3 的cDNA 中，经体外转录，与其他基因组RNA 共感染烟草原生质体，）- 干扰素的mRNA 累积水平和表达水平都比用CaMV35s 启动子高5 倍。1989 年，

Dawson 用烟草花叶病毒（TMV）载体系统表达了CAT 基因，发现其表达率非常高。＠单链DNA 植物病毒载体系统，是由单链环状DNA 分子组成，一般存在成对的2 个病毒颗粒。这种二连基因组可以把外源基因插入其中1 种DNA 上而不影响另1 种DNA 基因组的复制。Ugaki 等利用小麦矮缩病毒（WDV）的基因组为基础构建了穿梭质粒，转到玉米胚乳原生质体中，检测到报告基因的表达。

Hohn 等则用玉米条纹病毒（MSV）载体系统研究玉米转座子系统。＠双链DNA 植物病毒载体系统，是将其病毒基因组中对病毒繁殖非必需的1 段核苷酸序列去掉，换上1小段外源DNA 而不影响病毒基因组正常包装。用这样重组的病毒载体感染植物细胞以获得外源基因的转移。目前研究和应用主要集中在花椰菜花叶病毒（CaMV），把二氢叶酸还原酶基因插入CaMV 构建稳定重组病毒载体侵

染芜菁后，使芜菁产生氨甲喋呤的抗性。另外用原仓鼠金属硫基因的重组CaMV 侵染植物，在感染的植物叶片中检测到。综上所述，这类载体比较小，便于在实验中操作，而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞，外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。但是病毒载体的容量有限，不能包装大片段的外源DNA 基因组，寄主范围窄，复制稳定性差，转录和复制机理复杂。故至今还没有确定的证据表明，植物病毒是否可以整合进植物细胞的基因组中。有人认为转入的外源基因稳定遗传的可能性不大。因此，目前植物病毒载体系统还未得到广泛使用，但它仍然是植物转化方面的一个重要领域。2、DNA 直接导入法

由于载体介导法所涉及的技术面广，操作要求高，而且比较繁琐，所以近年来DNA 的直接导入法应用日益普及。DNA 直接导入法用得最多的植物材料是原生质体，另外还有植物器官分生组织、未成熟的胚、愈伤组织、细胞、花粉等。DNA 直接导入法一般使用大肠杆菌的质粒作为载体，也可以直接用外源DNA 导入植物细胞。DNA直接导入法可分为：化学物质诱导法、电激穿孔法、脂质体法等。

2.1 化学物质诱导法现在用得最多的物质是聚乙二醇（polyetlcyleneglycol，PEG），它能与原生质体融合，影响原生质体膜的通透性，致使原生质体较好地吸收外源DNA。PEG 通过电荷之间的相互作用，与DNA 形成紧密复合物，植物细胞通过内吞作用吸收这些复合物。一般PEG 浓度较低时，不对原生质体造成伤害，而获得的转基因植株来自同1 个细胞，避免了产生嵌合转化体，转化稳定性和重复性好，但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用，且转化率低，一般在10 - 5 ~ 10 - 6。这种方法首先用在模式植物烟草上，转导象Ti 质粒那样比较大的质粒。在添加PEG 和外源DNA 时，人们已成功地将外源基因整合到原生质体基因组，并得到表达。利用原生质体的全能性，目前此种方法已在多种禾谷类作物如水稻、大麦、玉米及一些双子叶植物中获得了转基因植株。

2.2 电激穿孔法电激穿孔法是20 世纪80 年代初发展起来的一种遗传转化技术。植物细胞膜在外界高压电脉冲下会造成非对称穿孔，这种在细胞膜上出现的短暂可逆性开放小孔，为外源基因提供了通道，DNA 分子有可能通过小孔进入细胞内并整合到受体细胞的基因组上，但细胞本身的生理活动受到的影响不大。由于质膜具有可修复性，外加电压造成的膜穿孔在一定时间内可以自动修复，使细胞恢复到正常生理状况。1985 年，Michael 等人首次利用高压脉冲（1 400 V）处理使细胞质膜产生可修复的穿孔，从而将外源基因转入植物细胞，并在受处理的原生质体培养2 ~ 4 c 后，检测到外源基因的瞬时表达。自此，电激穿孔法先后在烟草、玉米、水稻、马铃薯、番茄、大豆、小麦等作物原生质体上获得成功。1986 年，Morikawa 等人进一步用带壁植物细胞或组织，同样实现了外源基因的转移，使受体范围进一步扩大。

2.3 脂质体法脂质体法是近年来才建立的一种转化技术，就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合，从而达到转基因的目的。Gregoriacis 利用脂质体介导生物大分子进入动物细胞。至今，脂质体介导法已成为动物细胞转化最为有效的手段。Cassells 用脂质体成功地将双乙酸荧光素分子导入到番茄原生质体中。直到Deshayes 等用脂质体介导法将带有NPTi基因的质粒PLGVneo 转化烟草叶肉原生质体，这是第1 篇用脂质体介导转化植物原生质体，实现稳定转化的成功报道。随后，朱祯等用转化脂将含有NPTi的质粒pIG3031 导入水稻原生质体，获得外源基因在水稻细胞中正确表达的转基因植株。表明脂质