酶的定向进化方法

摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略. 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶. 短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径.关键词蛋白质工程模拟定向进化-------------------------------------------------------------理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力.------------------------------------------------------------- 1 定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”〔2〕. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的.------------------------------------------------------------- 2 随机突变的策略2.1 易错PCR易错PCR（error-prone PCR）〔3，4〕是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配, 导致目的基因随机突变. 然而，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR（sequential error-prone PCR ）策略. 即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板, 连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变. Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的DMF中, 催化效率kcat /Km分别是野生酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定向进化〔2〕, 产生的突变体13M的kcat /Km比PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍.在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换.2.2 DNA改组和外显子改组DNA改组（DNA shuffling）〔7，8〕又称有性PCR(sexual PCR)，原理如图1所示. 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变〔9〕, 而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体〔10～15〕.外显子改组（exon shuffling）〔16，17〕类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库.2.3 杂合酶杂合酶（hybrid enzyme）〔18〕是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合酶，如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合. 杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子. 杂合酶方法的有效性和实用性已得到了实验的证实〔19～25〕.2.4 体外随机引发重组体外随机引发重组（random\|priming \%in vitro\% recombination, RPR）〔26〕以单链DNA为模板, 配合一套随机序列引物, 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段, 由于碱基的错配和错误引发, 这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中, 它们互为引物进行合成, 伴随组合, 再组装成完整的基因长度. 如果需要, 可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质（图2）.该法优于DNA改组法的特点在于：（1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可10～20倍地降低亲本DNA量; （2）在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去DNase Ⅰ, 故RPR方法更简单; （3）合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变; （4）随机引发的DNA合成不受DNA 模板长度的限制.2.5 交错延伸交错延伸（stagger extension process, StEP）〔27〕原理的核心是, 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 并大大缩短其反应时间(55℃, 5 s), 从而只能合成出非常短的新生链, 经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸. 此过程反复进行, 直到产生完整的基因长度, 结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA 分子(图3).StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化过程〔28〕. 该法简便且有效, 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具.2.6 酶法体外随机-定位诱变为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis)〔29～32〕. 该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配.从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的推动作用.-------------------------------------------------------------图1 DNA改组原理图2 体外随机引发重组原理图3 交错延伸原理------------------------------------------------------------- 3 定向进化的选择策略尽管用上述方法可向人类提供新的有价值酶,但酶的功能突变常常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中. 采用回交（back-crossing）法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组〔33〕, 可排除这种干扰. 这样, 出现中性突变的频率只是50%, 可全部去除不利突变. 在定向进化中, 尽管突变具有随机性, 但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势, 加之控制实验条件, 限定突变种类, 降低突变率, 缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量, 更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度.通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关〔34，35〕. Venekei等人〔36〕报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（X-ray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛选了44 000个突变株.Roberts等人〔37〕用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.6×106倍的突变体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍〔38〕.另有一些其他的筛选方法〔39，40〕, 如加入能产生可见光信号的底物〔17〕或利用绿色荧光蛋白的荧光性质〔41〕等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其成败.------------------------------------------------------------- 4 定向进化的优势、现状和未来较之蛋白质分子的合理设计, 酶的体外定向进化属于非合理设计（irrational design）. 其突出的优点是, 不需事先了解酶的空间结构和催化机制. 它适宜于任何蛋白质分子, 大大地拓宽了蛋白质工程学的研究和应用范围. 特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题〔11，42～44〕，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用（如药物设计等）奠定理论基础.此外,该技术简便、快速、耗资低且有实效. 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的蛋白质工程研究的新策略. 它不仅能使酶进化出非天然特性, 还能定向进化某一代谢途径; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶, 还可能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加, 产生具有多项优化功能的酶，进而发展和丰富酶类资源; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年〔10〕，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃. 目前，对一些酶（或蛋白质）(表1）、砷酸盐解毒途径〔45〕、抗辐射性〔46〕、生物合成途径〔47〕、对映体选择性〔48〕、抗体库〔49〕以及DNA结合位点定向进化〔50〕的可喜成果令众多的相关科学家为之振奋. 可见, 进化能发生在自然界, 也能发生在试管中，它与合理设计互补, 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋白质）分子, 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景.表1 酶的体外定向进化应用实例应强调的是, 为了提高酶体外定向进化的成功率, 需注意以下几个关键问题:（1）确定目的酶在所需功能方面的进化程度和潜力; （2）选择一个最接近人们需要的酶分子作为起点（包括用作下一循环的起始突变体），这涉及将酶引入单一的进化途径，如果选择失误, 便可能中途“夭折”; （3）若用于理论研究, 应控制较低的突变率，只有选择最佳进化策略，保证库中所有克隆只含有单一氨基酸取代(每代只有一个氨基酸变化), 那么从一代到另一代的功能变化便能与突变表型一一对应起来; （4）建立有效且灵敏的选择方法, 确保检测出由单一氨基酸取代而引起的功能变化.目前, 已建立了一些酶（或蛋白质）的体外定向进化的有效方法, 但还应探索扩展定向进化潜力的最佳途径和提高对突变的控制能力. 选择方法尚待开发与完善, 有必要发展小型化分析和高度自动化的大规模选择模式, 特别是对那些无明显可借鉴表型的突变体的选择, 可能是今后该领域科学家切实努力的目标.-------------------------------------------------------------。