微生物制药实验方案

植酸酶高产菌株的筛选与酶的分离纯化

刘晓娇柳青邓平吉鹏朱奇峰

一、研究意义

植酸酶是催化植酸及植酸盐水解为肌醇与磷酸（磷酸盐）的一类酶的总称。植酸及其盐类普遍存在于植物体中，是植物种子及营养器官中磷的主要贮存方式，一般植酸磷占禾谷种子及油料作物总磷60%~80%。在人和单胃动物食物中，植酸具有强烈的抗营养作用。这是由于一方面人和单胃动物缺乏分解植酸的酶类，无法利用植酸中的磷，另一方面植酸能与矿质元素如铁锌、钙和镁等蛋白质形成不溶性的稳定的复合物，降低了矿质元素和蛋白质的利用率。植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。

二、实验目的

从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株，利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和Sephadex G-100 凝胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。

三、实验材料

3.1 材料

3.1.1（1）筛选培养基：1%植酸钙，3%葡萄糖，200U/ml 青霉素钠，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO

4.4H2O，0.05%MgSO4.7H2O，0.003% FeSO4·7H2O，1.5%琼脂，pH

5.5。

（2）液体发酵培养基：1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.003% FeSO4.7H2O，pH5.5。

（3）查氏合成培养基：硝酸钠 2g，磷酸氢二钾 1g，氯化钾 0.5g，硫酸镁 0.5g，硫酸亚铁 0.01g，蔗糖 30g，琼脂 15~20g，水 1000mL，pH 自然，121℃灭菌20min。

（4）斜面培养基：0.05%MgS04·7H2O，0.003%MnSO4·7H2O，0.003%FeSO4·7H20，麸皮汁100ml，1.5~2%琼脂，pH5.5。

3.1.2 土样来源

土样采自校园共青团花园或农田。去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层

5cm~10cm的土壤。

3.2 仪器

水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉、干燥箱、超净工作台、移液管等

四、实验方法

4.1 流程

4.2 方法

4.2.1 菌株的筛选：土壤样品稀释1×105倍，涂布于筛选培养基上，30 ℃培养72 h，挑取产生透明圈的菌株。对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛，在220 r/min 的转速下发酵培养，测其酶活。

4.2.2 酶活的测定：参照张若寒的钒钼酸铵法略加改进后进行测定。取1 ml 粗酶液加入2 ml 植酸钠溶液并摇匀（对照加入2 ml 钒钼终止液），37 ℃保温反应30 min，立即加入2 ml 钒钼终止液（对照加入2 ml 植酸钠溶液），415 nm 测OD 值，参照磷标准曲线计算酶活。酶活定义：按上述方法，在pH

5.5 的条件下，每分钟从0.0051 mol 的植酸钠溶液中释放1 umol 无机磷所需的酶量为一个活力单位（U）。

4.2.2.1 磷标准曲线制备

原理：利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性钼一钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415nm波长下测定磷的含量。

按表1加入试剂后，在415nm波长下测OD值，并绘制标准曲线。

4.2.3 菌种鉴定：将复筛酶活力最高的菌接种于查氏合成培养基上，28 ℃恒温培养箱培养

3 d 后，观察菌落形态变化。

4.2.4 诱变处理：取复筛酶活力最高的菌接的孢子悬液10 ml 加入直径为9 cm 的无菌培养皿中，在15W紫外灯下，距离28 cm，进行诱变处理，时间依次为0、3、6、9、12、15min。经紫外线诱变后得到的突变株，将其中透明圈与菌落直径比值较大的进行复筛，测定突变株的酶活。

4.2.5 植酸酶的分离纯化：①取发酵后的培养液在4 ℃，4000 r/min 离心20 min，取上清液，分别加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度分别为20%~90%，对植酸酶进行沉淀。沉淀重新溶解在乙酸缓冲液中，对蒸馏水透析脱盐。②透析后的植酸酶溶液用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱进行分离纯化，用NaCl 溶液进行线性梯度洗脱，于280 nm 检测蛋白质，分部收集，测定每管酶活力。③将上述洗脱液用Sephadex G-100 凝胶柱进一步分离，用乙酸缓冲液进行洗脱，于280 nm 波长检测洗脱液中蛋白质的含量，记录洗脱曲线，分部收集酶活力较大的部分。

4.2.6 酶学性质研究：①用纯化的植酸酶分别在pH 2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、

5.5、6、

6.6、7、

7.5、8的乙酸缓冲液中进行酶促反应，测定酶的最适pH。将不同pH的植酸酶溶液，在37 ℃处理30 min，测定酶活力，研究酶的pH 稳定性。②纯化后的植酸酶溶解在乙酸缓冲液中，分别在不同温度（20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃）下进行酶促反应，测定植酸酶的最适温度。将植酸酶溶液分别在不同温度下保温30min，再在37 ℃测定酶活力。

4.3 正交试验

4.3.1 明确实验目的，确定实验因素，影响发酵的因素很多，考虑到实验室条件及人力和时间，我们不能在一次试验中包括所有因素，本实验主要从葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、植酸钠4个重要因素，每个因素选择三个水平，采用正交表L9（34）进行探索。

4.3.2 列出水平表（见表1）。根据生产上发酵的现有了解，把葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵、植酸钠四个因素各分成三个水平。

4.3．3 选择正交表：根据人力、物力、试验任务，确定因素水平后，选出正交表。表头中L表示正交表，L右下脚9表示有9行，可用来安排9个试验。括号内底数3是因素水平数，指数4是4个因素（见表2）

4.3.4 根据因素水平（表头设计），把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字。

表1 正交表试验设计（%）

因素葡萄糖蛋白胨硫酸铵植酸钠

1 2 0.2 0.4 0.05

2 3 0.4 0.3 0.10

3 4 0.6 0.2 0.15

表2 正交表实验方案

编号葡萄糖蛋白胨硫酸铵植酸钠评价指标

酶活（U/ml）

1 1 1 1 1

2 1 2 2 2

3 1 3 3 3

4 2 1 2 3