寡核苷酸介导的定点诱变
第七章定点诱变
第七章定点诱变第七章定点诱变［本章摘要］突变有重复、缺失、倒位、易位四种类型。
定点诱变主要是关于：简单的插入或缺失，单个碱基的置换以及系统的缺失、插入或成串碱基的置换。
寡核苷酸介导的定点诱变主要是对单个或少数几个碱基的操作；外切核酸酶Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ介导嵌套缺失，可以得到系列缺失体。
第一节：寡核苷酸介导的诱变70年代初j×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象。
即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。
由此可利用突变的DNA 片段将突变引入到野生型DNA 中。
一、Kunkel法或称“U” 法1．背景介绍dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把dUTP 转化为dUMP ，因此细胞内dUTP 的含量大为增加，其中一些dUTP 可掺入DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。
ung -UDG 酶缺陷，UDG 酶[尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除去掺入DNA 中的尿嘧啶残基。
2．原理Kunkel 法原理如图7-1 所示，过程包括：①当目标DNA 插入phagemid 载体并进入E.coli CJ236 后。
②由于该菌体ung- dut-突变，合成的DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。
③M13K07 辅助感染下，产生带U 的单链DNA 。
④与引入诱变的Oligo 复性。
⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下，以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。
⑥感染dut+ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
分子生物学问答题
1.什么是转座? 转座因子在一个DNA分子内部或者两个DNA之间不同位置间的移动。
2.病毒基因组有哪些特点?答：不同病毒基因组大小相差较大;不同病毒基因组可以是不同结构的核酸；除逆转录病毒外,为单倍体基因组；病毒基因组有的是连续的，有的分节段；有的基因有内含子;病毒基因组大部分为编码序列;功能相关基因转录为多顺反子mRNA有基因重叠现象。
3.原核生物基因组有哪些特点?答：基因组由一条环状双链DNA组成；只有一个复制起始点；大多数结构基因组成操纵子结构；结构基因无重叠现象；无内含子，转录后不需要剪接；基因组中编码区大于非编码区；重复基因少，结构基因一般为单拷贝；有编码同工酶的等基因;基因组中存在可移动的DNA序列；非编码区主要是调控序列。
4.真核生物基因组有哪些特点？答：每一种真核生物都有一定的染色体数目；远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大；真核生物基因转录为单顺反子；有大量重复序列；真核基因为断裂基因;非编码序列多于编码序列;功能相关基因构成各种基因家族。
5.基因重叠有什么意义？答：利用有限的核酸储存更多的遗传信息，提高自身在进化过程中的适应能力。
6.质粒有哪些特性？答：在宿主细胞内可自主复制；细胞分裂时恒定地传给子代;所携带的遗传信息能赋予宿主特定的遗传性状；质粒可以转移.7.什么是顺式作用元件? 答:基因中能影响基因表达，但不编码RNA和蛋白质的DNA序列.顺式作用元件主要包括启动子、增强子、负调控元件等。
8.简述原核基因表达的特点。
答：（1）只有一种RNA聚合酶。
(2)原核生物的基因表达以操纵子为基本单位。
（3)转录和翻译是偶联进行的。
（4)mRNA：翻译起始部位有特殊的碱基序列-SD序列。
（5）原核生物基因表达的调控主要在转录水平，即对RNA合成的调控.9.简述σ因子在原核基因表达调控中的意义.答：（1)6因子含有识别启动区的结构域调控RNA聚合酶与．DNA结合，确保RNA聚合酶与特异启动区而不是其他位点的稳定结合（2）6因子使得RNA聚合酶选择一套特定启动区起始转录。
基因工程题库版--名词解释
各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。
测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。
6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。
)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。
基因定点突破
远见力
决策力
创新力 执行力
感召力
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第四月 第三月 第二月 第一月
73% 82% 56%
32%
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第一月
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第三月 第四月
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大引物PCR megaprimer PCR
1.用引物P1和含突基因的 引物P2扩增模板DNA产 生双链大引物(PCR1).
2.纯化大引物，去除PCR1 剩下的引物和脱氧核苷酸， 同时加入引物P3，形成带 突变基因的双链DNA
3. 扩增带有突变基因的双 链DNA
三种经典基因定点突变方法比较
1 寡核苷酸引物介导的定点突变法 其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高 缺点是操作过程环节复杂、周期长， 而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。
最新食品生物技术导论复习题
一、名词解释诱变育种:利用诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种的方法。
代谢控制发酵:是指利用生物的、物理的、化学的方法，人为的改变微生物的代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。
寡核苷酸介导诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis):指在DNA水平上改变氨基酸的编码序列，也称定点诱变(site-specific mutagenesis);补料分批培养:在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。
临界溶氧浓度:指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。
诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成，这样的酶叫诱导酶固定化酶:通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶.非水酶学:通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学.抗体酶:是一种具有催化作用的免疫球蛋白，属于化学人工酶细胞培养:是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织．愈伤组织:在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
接触抑制:细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。
细胞系:原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。
抗性互补筛选法:利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。
细胞拆合:是指以一定的实验技术从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器．基因重组 (gene recombination):是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
食品生物技术导论复习题1
一、名词解释诱变育种:利用诱变剂处理微生物细胞, 提高基因突变频率, 再通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种的方法。
代谢控制发酵:是指利用生物的、物理的、化学的方法, 人为的改变微生物的代谢途径, 使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。
寡核苷酸介导诱变( ):指在水平上改变氨基酸的编码序列, 也称定点诱变( );补料分批培养:在分批培养过程中补入新鲜的料液, 以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。
临界溶氧浓度:指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。
诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成, 当加入诱导物后就会大量合成, 这样的酶叫诱导酶固定化酶:通过物理的或化学的方法, 将酶束缚于水不溶的载体上, 或将酶束缚于一定的空间内, 限制酶分子的自由流动, 但能使酶发挥催化作用的酶.非水酶学:通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的, 研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学.抗体酶:是一种具有催化作用的免疫球蛋白, 属于化学人工酶细胞培养:是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长, 此时细胞不再形成组织．愈伤组织:在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
接触抑制:细胞从接种到长满底物表面后, 由于细胞繁殖数量增多相互接触后, 不再增加。
细胞系:原代细胞经第一次传代后, 形成的细胞群体, 即具有增殖能力, 类型均匀的培养细胞, 一般为有限细胞系。
抗性互补筛选法:利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂与其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。
细胞拆合:是指以一定的实验技术从活细胞中分离出细胞器与其组分, 然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器与其组分进行重组, 使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器.基因重组 ( ):是指片段在细胞内、细胞间, 甚至在不同物种之间进行交换, 交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
克隆:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
限制性内切酶:限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶, 能将外来的切断, 由于这种切割作用是在分子内部进行的, 故名限制性内切酶。
浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用
浅析基因定点诱变在蛋白质工程中的应用作者：胡文斌朱云波来源：《中学生物学》2013年第08期在蛋白质工程中对蛋白质结构进行的设计改造，最终还必须通过基因来完成。
设计改造后的蛋白质在自然界生物中不存在相应的基因，往往需要通过人工化学合成或基因修饰获得，其中基因修饰的主要方法就是基因定点诱变。
如在高中生物人教版选修3教科书“蛋白质工程的崛起”这一节中谈到：“将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。
”这个实例中，改造后的蛋白质基因与原始基因只有一个碱基对的差异，其所用的方法就是基因定点诱变。
但是，基因突变往往是不定向的，是随机的，研究者如何让基因按照人的意愿进行定向突变呢？为什么没有用化学合成法合成基因呢？化学合成法有什么弊端吗？下面就这些问题作简要分析和阐述。
1 基因定点诱变的原理和方法基因定点诱变技术是蛋白质工程研究中的一种重要方法，其实质是利用化学合成寡核苷酸和基因重组技术相结合的方法，按照预定设计，对已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。
最具代表性的定点诱变方法有以下三种。
1.1 寡核苷酸介导的定点诱变利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突变，而不受限制酶切点的限制（图1）。
如果希望改变某个DNA的某个特定碱基，可以先合成一条突变碱基位于中间的寡核苷酸，一般长度约15～20 bp。
这条寡核苷酸链除了突变碱基外，其余的序列与野生型DNA分子中的相应序列完全一致。
然后将合成的寡核苷酸与由单链噬菌体做载体所携带的DNA克隆互补链混合，进行分子杂交。
这段配对的寡核苷酸可以做为引物，在DNA聚合酶作用下合成完整的互补链，再用DNA连接酶连接起来。
将此双链DNA导入大肠杆菌中，经扩增就可以得到大量可稳定遗传的的突变DNA克隆。
1.2 盒式定点诱变盒式定点诱变是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
寡核苷酸介导的定点诱变
Kunkel诱变法（The
Kunkel Mutagenesis Method）
这是1985年由Kunkel等人建 立的一种寡核苷酸引物诱变法， 该法的操作步骤如下：①将复制 型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷 三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺 陷的E. coli（dut-，ung-）菌株中 生长，使U取代T掺入到DNA链中 （一般每个重组体20~30个）；② 以此种带U的DNA链为模板，用带 突变碱基的寡核苷酸引物进行复 制，产生异源双链；③将此异源 双链转化到ung+菌株中生长，含 U的模板链被破坏，从而使子代 DNA链大部分（~80%）含突变碱 基序列
快速引物诱变
（QuikChange Primer Mutagenesis） 这是由Stratagene公 司开发的一种引物定点诱 变法，该法的操作步骤如 下：①将带目的基因的重 组体在dam+菌株中扩增， 使DNA序列被dam甲基化 酶所修饰；②使用带突变 碱基的寡核苷酸引物，在 较高温度下复制子代链， 形成双链突变体；③用限 制酶DpnⅠ将带甲基化标记 的亲代双链水解；④将突 变体转化宿主细胞
将突变体转化宿主细胞限制酶位点消除引物诱变primermutagenesisrestrictionenzymesiteelimination限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的dna片段的特性去除不含突变碱基的亲代模板链以提高定点突变效率的技术方法
•
限制酶位点消除引物诱变（Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Elimination）
•
限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割 由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的DNA片段的特性，去 除不含突变碱基的亲代模板链，以提高定点突变效率的技术方法。 限制酶位点消除法的操作步骤是：①将带突变碱基的寡核苷 酸引物与重组体单链模板退火后，加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复 制，产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链DNA；②用特定的限制酶在 此异源双链DNA上作切口，此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而 被切开，而新合成的子代链则无法切割；③使用核酸外切酶将亲代模 板链全部水解去除，然后再以含硫代磷酸核苷酸的子代单链为模板， 经二次复制合成双链
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
33
• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
寡核苷酸介导的定点突变
寡核苷酸介导的定点突变
寡核苷酸介导的定点突变是指利用寡核苷酸片段介导
CRISPR/Cas系统对DNA序列进行定点修改，以达到改变目
标基因特定功能或拓展其功能的目的。
该技术主要基于CRISPR/Cas系统的结构与功能，通过寡核苷酸片段与Cas9蛋
白复合，选择性地靶向DNA双链切割，并介导DNA修复或
编辑。
具体操作步骤为：首先、设计合适的寡核苷酸片段和引导RNA，使其能够高效而准确地识别目标基因的DNA序列；然后、引导RNA与Cas9蛋白结合形成RISC复合物，在靶标DNA序列中寻找“NGG”位点，Cas9蛋白进行双链DNA切割；最后、通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组修复(HDR)机制实现DNA序列的定点突变。
该技术具有定点精准、高效、快速、低成本等优点，可以广泛应用于基因组学研究、遗传病治疗等领域。
基因定点突变
PCR介导的定点突变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
盒式诱变
应用：SOD酶化学修饰研究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
结果
定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序 列对比3个质粒的测序结果有2种，分别和文 献的Cu，Zn-SOD序列对比： 其中1个质粒测序结果和Cu,Zn-SOD基因 序列完全一致，说明突变未成功； 另外2个质粒分别有2个碱基和Cu,Zn-SOD 因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成 了Ala的密码子GCC，其他序列与Cu，ZnSOD基因一致，符合预期要求。
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
第十章_DNA诱变
第一节 随机诱变
体外随机诱变：随机地在克隆化DNA中引入碱基臵
换突变。 特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变 的位臵及其性质是随机的；在目的DNA片段中引入 大量的序列多样性，得到的突变体可能是单点突变 ，也可能是多点突变。 成功的关键有二：1、选择合适的突变率；2、有效 的定向选择或筛选方法。 方法：错误掺入诱变、盒式诱变、增变菌株诱变、 化学诱变。
二、盒式诱变
盒式诱变（cassette mutagenesis）：是一种定点
突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化 学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取 代。 包括简单的盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种 方式。 简单的盒式取代诱变是通过限制性内切酶切除特定 的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡 核苷酸连接，得到取代突变，是一种定点诱变。 若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸 ，则可在限定区域内引入大量的随机突变。
2、重叠延伸PCR诱变
使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮PCR
扩增；将扩增产物进行重叠退火延伸，获得带突变碱基的完整序列 ；使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩增。
应用：重叠延伸剪接术（SOE）
可用于将两个 DNA 片段在所期望的位点进行连接。
包括两个步骤：
一、DNA洗牌法
DNA洗牌法（DNA Shuffling）：体外同源重组技术
。将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸 酶Ⅰ消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文 库，使之互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因 拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互 换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作 为新一轮的体外重组。
基因工程第七章DNA定点诱变
• 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果
错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的 杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有79bp完全配对;
• 为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长
度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在 中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体 之间的热稳定性差异足够大。
位点选择定点诱变法
三、Transformer SiteDirected mutagenesis
转化子诱变法
Synthesize second strand
Digest DNA (primary digestion)
Transform E.coli mutS to propagate plasmids
ATG ATG
ATG ATG
BamHI
ATG
BamHI
PCR ATG
ATG
EcoRI
PCR
ATG
EcoRI
重叠延伸
BamHI
ATG
PCR EcoRI
第二节 嵌套缺失
第二节 嵌套缺失
1. 外切核酸酶III的消化
Exonuclease III 5‘ 3‘
5‘ 3‘
5‘ 3‘
2. BAL 31的消化
DNA ligase
U
U
U
U
U
2．原理
Insert target DNA
转化 E.coli CJ236
U
U
U U
U
U
Isolate phagemid ss DNA 与突变寡核苷酸退火
转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)
UU
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
14
一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
基因工程8-DNA诱变(完整)
一、DNA洗牌法（DNA shuffling）
美国Stemmer 于1994 年首次提出 。
DNA shuffling技术是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理
或在DNaseI的作用下随机切成小片段，然后在没有引物的情况下，采用有 性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前
三、随机引发重组
(random priming in vitro recombination，RPR) RPR以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生 大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配 和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在 随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合， 再组装成完整的基因长度。 该法可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA 为模板进行随机引发重组。
体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当
的功能分析可鉴别携带突变的重组子。
常用的化学诱变剂：
• 烷化剂
1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐——甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES） 2. 亚硝基烷基化合物——亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU） 3. 次乙胺和环氧乙烷类——乙烯亚胺（EI） 4. 芥子气类——氮芥类、硫芥类
随机诱变
体外随机诱变：指随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。 特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置随机； 结果：在目的DNA片段中引入大量的序列多样性； 方法：错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变； 用途：诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，从而改造蛋白质的 性质或活性，得到符合需要的蛋白质。 定向进化：对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果， 通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的 性能改良的蛋白质，又称为试管进化。
基因定点诱变
使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制，随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子 制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变 链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局 部消化后，进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
2.4.３ ＰＣＲ诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡 核苷酸引物诱变能力仅限于5’ 端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补 的带有突变碱基的内侧引物和 2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一 轮PCR产物为第二轮PCR引 物
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定点突变技术
操作：设计引物，分别PCR，前两次PCR 反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需 纯化,直接将胶条切下置于EP管中, 80℃冷冻10min,然后将胶条离心后分 别取上清液作为模板进行第三次PCR,以 获得全长的突变目的基因
PCR介导的定点突变法其优点是操作较简 单，突变的成功率可达100%。但它亦 有两个缺点:①后续工作较复杂，PCR扩 增产物通常需要连接到载体分子上，然
寡核有酸引物介导的定点突变 法其优点是保真度比PCR突变法 高，经过改进后使该方法突变少 成功率大大提高，缺点是操作过 程环节复杂制。
盒式突变法具有简单易行、突变效率高 等优点，还可以在一对限制酶切位点内 一次突变多个位点。缺点是合成多条引 物的成本较高。另外，在一般情况下， 在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在 一对限制性酶切位点的要求，限 制了该 方法的广泛应用。然而一旦具备了这样 的条件该方法则为首选。
定点突变技术
刘微
基因的定点突变技术
点突变的技术有很多种，常见的有： ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
（M13噬菌体法） ㈡ 盒式诱变 ㈢PCR点突变技术
1.引物PCR定点诱变法 2.重组PCR定点诱变法 3.重叠延伸PCR技术
寡核苷酸引物诱变技术 （M13噬菌体）
噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体 粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后， 通过复制以双链形式存在。将待研究的基因 插入载体M13，制得单链模板，人工合成一 段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基） 作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶 连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双 链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类 型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。
重组PCR定点诱变2
操作：设计引物，分别PCR， 从两个PCR反 应管中各取出3μl PCR反应产物,混匀后用 CaCl2转化法转化至感受态大肠杆菌中。涂 平板后,从转化的细菌菌落中随机挑选若干,筛 选。
基因定点突变技术.
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
2寡核苷酸引物诱变使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物启动单链dna分子进行复制随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成dna子链的一个组成部分因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列?将待突变的目的基因插入将待突变的目的基因插入m13噬菌体载体上制备单链噬菌体载体上制备单链dna?将合成的寡核酸片段在与单链模板退火在dna聚合酶的作用下合成互补的双链聚合酶的作用下合成互补的双链dna?将双链dna转化大肠杆菌获得突变基因转化大肠杆菌获得突变基因?突变体的筛选
定点突变技术通过寡核苷酸盒式诱变、寡 核苷酸引物介导、重叠延伸介导和大引物诱变 法介导（PCR介导）等途径来实现。盒式突变 是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核 苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，该 法虽简单易行，但成本较高。寡核苷酸引物介 导是利用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物， 在聚合酶的作用下启动对ＤＮＡ分子的复制， 该方法虽被广泛应用于基因调控、蛋白质功能 与结构之间的相互关系的研究中，但存在突变 效率低的问题；重叠延伸和大引物诱变法介导 的定点突变技术为基因修饰、改造也提供了另 一条方便的途径。但该方法后续工作比较复杂， 且易发生其他突变；
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• 盒式诱变（Cassette Mutagenesis） • 利用一段人工合成 的含有突变序列的寡核 苷酸片段，取代野生型 基因中的相应序列，从 而达到定点突变的目的， 称为盒式诱变。实施盒 式诱变时，要求靶DNA 插入点两侧有合适的限 制酶单一切点（图 4~5）。
盒式诱变的例子
•
限制酶位点消除引物诱变（Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Elimination）
•
限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割 由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的DNA片段的特性，去 除不含突变碱基的亲代模板链，以提高定点突变效率的技术方法。 限制酶位点消除法的操作步骤是：①将带突变碱基的寡核苷 酸引物与重组体单链模板退火后，加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复 制，产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链DNA；②用特定的限制酶在 此异源双链DNA上作切口，此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而 被切开，而新合成的子代链则无法切割；③使用核酸外切酶将亲代模 板链全部水解去除，然后再以含硫代磷酸核苷酸的子代单链为模板， 经二次复制合成双链
•
在大肠杆菌dut- ung-菌
株中生长的M13噬菌体的单链基
因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶 残基。用这些噬菌体感染ung+菌
株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链
遭到破坏，感染力下降约5个数 量级。 • 此法的成功关键，是要得到 好的含Ｕ单链模板DNA。
•
这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位 点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。
Kunkel诱变法（The
Kunkel Mutagenesis Method）
这是1985年由Kunkel等人建 立的一种寡核苷酸引物诱变法， 该法的操作步骤如下：①将复制 型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷 三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺 陷的E. coli（dut-，ung-）菌株中 生长，使U取代T掺入到DNA链中 （一般每个重组体20~30个）；② 以此种带U的DNA链为模板，用带 突变碱基的寡核苷酸引物进行复 制，产生异源双链；③将此异源 双链转化到ung+菌株中生长，含 U的模板链被破坏，从而使子代 DNA链大部分（~80%）含突变碱 基序列
•
引物诱变（Primer Mutagenesis）
利用一段含有突变序列的 寡核苷酸片段作为引物，经 DNA复制过程合成靶DNA片段， 使其子代链发生突变，称为引 物诱变。 引物诱变的基本操作步骤： ①获得单链目的基因；②人工 合成带突变序列的引物；③制 备异源双链DNA；④转染宿主 细胞；⑤筛选重组体；⑥突变 基因的鉴定和回收
在dut+的E. coli中
dUTP酶
dUTP
dUMP
在dUTP 酶缺失体中（dut- ）
Байду номын сангаас
dUTP
dUMP
dut：dUTPase突变，可导致E.colidUTP 的量增加，当DNA复制时，可在很多应 该加dTTP的位置加入dUTP。
•
在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖 基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中 的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株 中，此酶失活。
快速引物诱变
（QuikChange Primer Mutagenesis） 这是由Stratagene公 司开发的一种引物定点诱 变法，该法的操作步骤如 下：①将带目的基因的重 组体在dam+菌株中扩增， 使DNA序列被dam甲基化 酶所修饰；②使用带突变 碱基的寡核苷酸引物，在 较高温度下复制子代链， 形成双链突变体；③用限 制酶DpnⅠ将带甲基化标记 的亲代双链水解；④将突 变体转化宿主细胞