高中生物选修一 植物组织培养技术

1．基本实验室
1.1 洗涤 根据工作量的大小决定其大小，一般面积控 制在30-50m2。在实验室的一侧设臵专用的洗涤水 槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配臵2 个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大， 可以购臵一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门 用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还 应配臵落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。 地面应耐湿并排水良好。
三、无菌操作技术
人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。 器 皿 和 用 具 污染来源
培养皿：洗→热压 玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干 接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→
泡75%~95%酒精→烧
培养基：湿热
物品因素
培 养 材 料
外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理
内部细菌 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平
熏蒸灭菌
长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲 醛、高锰酸钾熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算， 高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后， 把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或 杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒 入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液 即挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲 醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥 发为气体。
（6）原生质体培养：对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养
矮牵牛茎尖离体培养培养
人参细胞 悬浮培养
三、植物组织培养技术的理论基础
植物细胞的全能性(Plant cellular totipotency） 从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有 该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条 件下，具有发育成完整植株的潜在能力。
分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育 过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发 生改变，形成不同组织或器官。
脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组 织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形 成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱 分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的 过程。
甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后 密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、 鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。 取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入 熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛 味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2 小时进行。 对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸
（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均 应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细 胞交叉污染。 （6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以 免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。 （7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方， 瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸 管丢掉。
整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要 迅速
正
确
错
误
防止操作带来的污染 接种过程中尽可能达到悬空要求
正
确Baidu Nhomakorabea
错
误
接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口
正
确
错
误
瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口
正
确
错
误
接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生
种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表 面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足
消 毒 剂 使用浓度(%)
70-75 10～20 0.1～1 10～12 4～50mgl-1 9 ～ 10
乙醇 新洁尔灭 氯化汞 过氧化氢 抗菌素 次氯酸钙/纳
消毒时间 (min) 0.1-3 5～30 2～15 5～15 30～60 5～30
效 果
好 好 最好 较好 较好 好
残液去除 难易 易 易 最难 最易 较难 易
4、用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验 用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器 械在其火焰上灼烧，冷却待用。 注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧。移液管不能灼烧，培养 瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。
5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定 的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3~4次，放入无菌 培养皿中，臵于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器 械进行分离、切割或其他处理。
药剂灭菌 烧灼灭菌 辐射灭菌
液体培养基、蒸馏水
培养材料 器械、瓶口、棉塞、包头纸 接种室、培养间
（1）干热灭菌
适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方 法：150℃ 、40min或120℃ 、120min，如 果发现芽孢杆菌，160℃ 、90～120min
（2）湿热灭菌
适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、 棉塞、纸等。121℃ 维持20～30min 注意点：加足水、排尽气、气压降到0时， 才能开盖
操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸
1、实验器具和材料的准备 2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超 净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台 面上的用品不要放臵太多或重叠放臵，以免降低 灭菌效果。
3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间， 以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。 进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下 工作台）
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；
（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显 微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：
根据不同分类的依据可以分为不同类型。
根据培养材料不同分为：
（1）完整植株培养：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。 （3）器官培养：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花的培养。 （4）组织培养：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。 （5）细胞培养：对单细胞或较小的细胞团进行培养。
正 确
错 误
接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形 态学上端露于空气中
正
确
错
误
四、外植体的选择与处理技术
用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源： 一是生长在自然环境下的植物；二是在温室控制 环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经过 离体培养的植物。
（一）、外植体的选择
1、选择优良的基因型 试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的 脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量， 就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱 毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植 物的快繁，也应选择有价值的植物。 2、取材 从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。 母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验 容易成功。
微量元素
微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所 需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co，Cl 其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注 意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等 毒害现象。
（4）射线灭菌
主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室 空气、操作台等，灭菌时间20～30min。 注意：关灯后5min后再进入。超净工作台 关灯后要打开风机。
（5）火焰灼烧灭菌
用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于 接种器皿的灭菌。
（6）消毒剂
适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。 几种常用消毒剂的效果比较
6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊 子将培养材料臵于培养基上，灼烧镊子放回， 灼烧瓶口，盖上瓶塞。 7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。
注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必 太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用 手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或 取备品更换。 （3）为拿取方便，工作台面上的用品 要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放臵在 右侧，左手用品在左侧，酒精灯臵于中央。（4）工 作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处 理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用 前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立 即封闭瓶口直立可增加落菌机会。
1.2配制培养基
配备的主要仪器设备有 ：天平、微波炉、pH计、 药品柜、器械柜、电炉、各种规格的培养瓶、培 养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶、 冰箱等。 冰箱用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药 品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同 感量。
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1.3 消毒
配备高压灭菌锅、排风灭火设备等。 如果没有条件的话，可以将上述工作合并成一 个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间 要明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。
§3.培养基的成分及其配制
一、培养基的成分及其作用
（一）无机营养物质
培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需
要连续的供给某些无机化学物质，除了C、H、O之
外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较
少的元素叫微量营养元素。
大量元素
•培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千 毫克。大量元素包括N, P, K, Ca, Mg, S。 培养基中加入量最多的是N，N一般以硝酸盐或氨 盐，或者两者结合的盐提供
1.4 无菌操作室
无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫 接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于 准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与 接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无 菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设 有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操 作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入 操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。 室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种 接种器械等。
（二）、灭菌的方法
1、物理方法：干热、湿热、过滤（0.25微 米）、紫外灯、超声波等。 2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒 精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、 双氧水、福尔马林等
各种灭菌方法及其使用范围
干热灭菌 玻璃器皿、器械
湿热灭菌
熏蒸灭菌
培养基、蒸馏水、器械、棉塞等
接种室、培养室
过滤灭菌
（3）过滤灭菌
培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调 节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、 血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度， 用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22～0.45 微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降 至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装。
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1.5 培养室
为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养 室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气 扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。一般要 分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应 有一预备间或走廊。 培养室应配有培养架、摇床、光照培养箱、生化培 养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养 架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在 20cm，光照强度为2000-3000lx。
一、植物组织培养的概念
1. 概 念 植物组织培养（Plant tissue culture） 广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上 对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体 甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征
（1）在培养容器中进行； （2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫 等的侵入； （3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度 等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
2.2、温室
为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。
§2
实验基本操作
灭菌
（一）、灭菌工作是极其重要的。
首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。 如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理； 火烤后的物体； 健康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）
细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具 有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、 组织和细胞的不同而异。
§1 §2 §3 §4
实验室设臵及仪器设备 实验基本操作 培养基的成分及其配制 培养条件的选择
§1
实验室设臵及仪器设备
实验室是进行组培研究的主要场所，应 能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌 操作、培养、鉴定等多方面的工作。