实验6 孚尔根反应

中国海洋大学实验报告
姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学
科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006
孚尔根反应
一、实验目的
1.熟悉并掌握孚尔根反应的原理及其实验操作方法
2.对细胞的组织化学研究方法有一初步的认识
二、实验原理
DNA的嘌呤碱基经稀HCl水解后产生的醛基，具有还原作用。

Schiff试剂（脱色碱性品红试剂）中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子，显现出紫红色，进而显示出DNA的分布情况，而且可以通过DNA被染色的颜色的深度显示其含量的多少。

细胞质会亮绿染液被染成绿色，已显示出富含DNA的细胞核的位置。

三、实验材料
①实验试剂
1、Schiff 试剂
2、1mol/L 盐酸
3、1%亮绿染液
4、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ
5、30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇水溶液
6、亚硫酸水（现配现用）
②实验材料
用carnoy 固定液固定的鱼肝脏切片；
③实验设备
显微镜、立式染色缸、恒温水浴锅、镊子、擦镜纸，盖玻片；
四、实验步骤
1、 取3个已制备的鱼肝脏切片，经二甲苯Ⅰ浸泡20分钟 ，二甲 1、 取3个已制备的鱼肝脏切片，经二甲苯Ⅰ浸泡20分钟 ，二甲苯Ⅱ浸泡
10分钟。

2、 依次经100%（Ⅰ）、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液浸泡5分钟。

3、将标本放入蒸馏水浸泡5分钟。

4、将标本放入1mol/L
盐酸的染缸5~10秒。

5、将标本放入60℃的1mol/L 盐酸水解8分钟。

6、将标本放入1mol/L 盐酸的染缸5~10秒。

7、将标本用蒸馏水浸泡，3次。

8、将标本放入Ｓchiff 试剂中染色1小时。

9、将标本用亚硫酸水洗3次，每次2分钟。

10、将标本用蒸馏水洗
3次，每次3分钟。

11、将标本用亮绿染色，各个标本分别染色20秒、30秒、40秒。

12、将标本用蒸馏水洗2次，每次浸泡3分钟。

13、将标本依次用30%、50%、70%、85%、95%、100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ) 的
乙醇溶液浸泡3分钟。

14、将标本再经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡8分钟。

15、在通风橱中使用中性树胶将标本封片。

16、在显微镜下观察标本。

四、实验结果
本次实验处理了三个样品，它们的区别在于使用亮绿处理的时间(20S、30S、40S)不同，综合了其他组不同染色时间的样品（10S、20S）的实验结果如下：
10S亮绿染色处理
30S亮绿染色处理
50S亮绿染色处理
五、总结：
三组实验样品经不同的亮绿染色时间处理后，经30S或40S亮绿染色处理所得到的切片染色效果最好。

染色时间过长会导致标本背景颜色过深而造成显微镜视野下对比度过小，使得实验结果不理想。

实验发现除来自于其他组亮绿染色10S处理的标本外，其他的标本的细胞质染色深度是逐渐增加的，原因可能是不同的标本来自于
不同的小组，处理存在差别。

六、思考题：
1、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

1、在转移标本时，要注意轻拿轻放，防止盖玻片脱落。

2 实验使用的二甲苯为中毒物质，使用时要特别注意，防止洒
到染色瓶外面。

3、转移标本时，要将标本放入染色瓶的卡槽里。

4、在染色过程中，相邻的标本不要接近，防止样品脱落。

5、在实验的第2步将标本经过一系列递减的浓度梯度的乙醇溶液浸泡处理的目的是创造使组织由石蜡的环境过渡到后续的水相的环境的过渡。

6、第4－6步使标本在稀盐酸的环境中浸泡是为了暴露醛基。

第4步是为了提供一个从蒸馏水到盐酸环境的过渡；第5步的水解时间和温度必须控制，时间过短、温度过低，会导致醛基暴露不完全；时间过长、温度过高，会导致醛基流失，造成后续染色失败。

第6步稀盐酸浸泡的目的是：①、在室温下终止反应②、防止试剂贴在切片上。

如果使用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出碱性品红，使得切片内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。

7、第9步中使用亚硫酸水溶液洗涤的目的是将多余的非特异性色素和扩散的染料洗掉。

8、第11步中使用亮绿染色，是使细胞质带上颜色，便于观察。

如果染色时间过短，细胞质的染色会过浅，不利于观察；如果染色时间过长，会使细胞质的染色过深，视野下的对比度过小，影响对样品
的观察。

9、第13步中使用递增的浓度梯度的乙醇水溶液对标本进行浸泡，目的是：①、将复染中残存的亮绿染液洗掉。

②、逐渐制造一个疏水的环境，为下一步二甲苯的处理和树胶封片准备。

10、第15步中，使用树胶封片时，要注意标本的正反面，切忌将树胶滴加到载玻片的反面，使得实验失败。

11、第15步中残存的树胶可以使用二甲苯将其洗掉。

12、在显微镜下观察标本时，因为标本较厚，在转换物镜时，要特别注意不要将物镜触及盖玻片。

2、在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？
答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff 剂染色时所残留的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。

使得视野中的染色目标清晰。