实验3 质粒的提取和鉴定,DNA酶切-Li revised

9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置 5min。室温放置15min干燥。 11．50µl TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 µg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存） 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼 脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
原理示意图
质粒DNA电泳
电场中DNA分子的迁移速度取决于：
• DNA分子本身的大小
• DNA分子的空间构型
–超螺旋构型（ccDNA)
–线形DNA(lDNA)
–开链环状DNA(ocDNA)
–复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一Βιβλιοθήκη Baidu)
•溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基 -5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到 核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出 橙色荧光
分离质粒DNA的 基本步骤
• 培养细菌使质粒扩增； • 收集和裂解细菌； • 分离和纯化质粒DNA
质粒DNA的提取方法
• 碱变性法（碱裂解法）； • 煮沸裂解法； • 羟基磷灰石柱层析法； • 质粒DNA释放法； • 酸酚法等。
碱变性（裂解）法基本原理：
在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双
开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。
• 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注 意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱
中去沉淀DNA。
DNA的限制性酶切
Plasmid (质粒)
• • • • Plasmid map Polylinker Sequence map Restriction enzyme map
Polylinker (多克隆位点）
Sequence Map
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTT AAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACA ACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCG ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAG GCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGG GTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCA ACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCC…… …
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质粒DNA提取常见问题
问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1.
2. 3. 4.
1.
请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液 的用量 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素 使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，臵于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
Attention, please!
• EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时， 应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将 该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！
质粒提取实验材料与试剂
• 实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a • 实验试剂：
– LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL （pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、 氯仿、Rnase、琼脂糖 – TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA – 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0， 新鲜配制）
碱变性法小量提取质粒， DNA的限制性酶切
厦门大学医学院
分子生物学实验教学组
实验目的
• • 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基
因和实验目的选择合适载体与限制性内切
酶，设计构建体外重组分子。
质粒(plasmid)
• 是染色体外能够进行自主复制的遗传单位， 包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和 叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分 子，在基因工程中质粒常被用做基因的载 体。
步骤一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37℃振荡 培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30 秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并 重复一次，弃上清，取沉淀。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm， 4℃，离心30sec，弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放 置1分钟。 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
加入溶液II 和III后防止剧烈振荡 ，可能把基因组DNA剪切成碎 片从而混杂在质粒中。细菌培 养时间过长会导致细胞和DNA 的降解，培养时间不要超过16 小时。
提高质粒产量的注意事项
• 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；
• 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核 酸变性； • 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复 性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分
2.
菌体老化
碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当
对 策
3.
4.
质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
原 因
1. 2. 3.
1.
混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA
不要使用过多菌体。重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚 等杂质 加入RNaseA室温放臵一段时间
对 策
2.
3.
螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双
螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链 不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，
变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不
能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力 密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合 物等一起沉淀下来而被除去。
• 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH， 1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液： 5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。