实验3 质粒的提取和鉴定,DNA酶切-Li revised
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定
③ 72℃ 8 分钟；
④ 4 ℃ 保温。 实验过程约1小时30分钟
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （30s）
形 成 DNA 2
循环2
循环3
72 50
条变 单性 链
50 ℃退火 （30s） 子链延伸
DNA加倍
72 ℃延伸 （60s）
DNA单链 与引物复 性
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和 反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性 30s， 50℃退火30s， 72 ℃延伸60s。如此周而复始，重复 进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
原理示意图
5
Template DNA
5
5 Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
•（五） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；
Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
①变性温度与时间
技术，通过测定荧光强度来对
PCR产物进行实时定量。
PCR相关技术
实验三 质粒DNA的提取与酶切
相对误差2～5％ 操作简便快速 应用广泛
光学光谱区
远紫外
（真空紫）
近紫外 可见
近红外
中红外
远红外
10nm~200nm 200nm ~380nm
380nm 780 nm ~ 780nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
复合光 氢灯 可见光分光光度计光源 （阳光及钨灯） 紫外分光光度计光源 三棱镜
实 验 三
重组质粒DNA的提取、酶切鉴定及电泳检测
紫外分光光度法检测DNA
实验安排
上午：
质粒DNA提取 限制性内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶制备
下午：
酶切产物的电泳 紫外分光光度法检测DNA 实验课题设计的要求与安排
问
题
1 提取质粒DNA和提取基因组DNA有何不同?
2 限制性内切酶与医学有何关系?
试剂：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂
仪器与设备：电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、
烧杯、吸管、微量移液器
3.实验方法和步骤
方法：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
步骤： 试剂准备
制胶 样品处理 电泳 染色与脱色
4.实验观察指标 ① 聚丙烯酰胺凝胶上电泳区带的分布 ② 电泳区带颜色深浅
5.实验预期结果的描述
重组DNA技术的一般过程
1.目的基因的获取 2.目的基因 和质粒载体 的连接
DNA片段（目的基因）与载体DNA分子相连接，形 成重组DNA
3.将重组DNA分子导入受体细胞 4.选择
选出含有所需要的重组体DNA分子的受体细胞
5.目的基因表达
目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质)
质粒提取,定量,酶切鉴定实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2018级临床卓越创新班组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2019-11-05 实验地点第四实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03一、实验目的1.学习并掌握碱裂解法提取质粒的方法2.掌握紫外吸收测定DNA的操作3.了解质粒酶切鉴定原理和方法4.掌握琼脂糖凝胶电泳技术原理，操作二、实验原理1. 碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
1）pH =12.6（碱性），染色体DNA：氢键断裂，变性。
质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
（不完全变性）2）（在1）溶液加入KAc溶液调节pH），中性，质粒DNA：复性，继续溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成了、缠连的网状结构。
3）离心后，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来2. 离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值的状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3. 质粒DNA定量测定：紫外光分光光度计法1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2）而且物质对光的吸收是具有选择性的3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱4）因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在紫外光260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。
5）DNA对波长260nm的紫外光有特异吸收峰，蛋白质在280nm紫外光处有特异吸收峰，A260/A280可以反应DNA纯度。
4.质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA5.琼脂糖凝胶电泳（有电荷效应，分子筛效应）不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动速率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。
实验三 质粒DNA的酶切鉴定课件PPT
5. 识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，
不能被切割。
2021/3/10
7
限制性内切酶的切割方式
内切酶切割后产生的三种末端
a) 5’ 突出的粘性末端 如, EcoR I 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’
b) 3’ 突出的粘性末端 如, Pst I 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’
• 影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实 验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间 与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。
• 酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总 体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确 定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较 好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL 。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+ 酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都 要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，离 心后保温酶切。
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
Xho Ⅱ
5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
2021/3/10
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
11
Sau3A
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
2021/3/10
9
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
质粒的提取与鉴定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。
同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。
关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。
实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。
三、 质粒DNA的提取和电泳鉴定
2. 质粒的酶切鉴定：
质粒DNA酶切反应体系 ▪ 10酶切buffer 1 l
▪ 质粒DNA
▪ EcoR1（10u/l）
5 l
1 l
▪ BamH1（ 10u/l ） 1 l
▪ ddH2O加至
10 l
▪ 37℃水浴保温1h；72 ℃水浴15min终止反应。
3.电泳检测目的基因片段
10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻
柔，同时控制好时间！
6. 加入 150μl 预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴 5min。一定要
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ充分混匀！
实验步骤
7.
8. 9.
4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP 管中。
加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清 液。 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
而染色体 DNA 、大分子 RNA 以及蛋白质 -SDS 复合 物等形成沉淀，可通过离心去除。
实验步骤
1. 在含相应抗生素（ Amp ）的 LB 中接入一单菌落（白色），于 37℃ 剧 烈振摇下培养过夜。 2. 取1.5ml对数生长期的菌体于 Eppendorf 管中，8000rpm 离心1min， 收集菌体。 3. 4. 5. 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加 入 200μl 新 鲜 配 制 的 NaOH-SDS （ 100μl 2mol/L NaOH+100μl
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
实验3质粒的提取和鉴定090226ppt课件
4. 操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防 止操作中对内切酶的污染。
5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备 一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、 乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均 在不同程度影响限制性内切酶的活性。
鲜配制）
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM
EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
• 9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。
• 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放 置5min。室温放置15min干燥。
• 11．50μL TE缓冲液（含无DNase的RNase 20 µg/ml） ，使DNA完全溶解（-20℃保存）
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含
Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，
37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，
质粒DNA的提取方法
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析 法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、 有机溶剂或碱进行处理及用加热处理
质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验3质粒的提取和鉴定
Ⅱ型限制与修饰系统
• 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它 们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内 进行切割，产生特异的DNA片段；
• Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅 助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复 顺序；
• Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口： 5’端突出，3’端突出和平末端。
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，（），10mM EDTA，2mg/ml 溶
菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 ，水 。
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。
• 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
双酶切实验材料
• 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ • DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 •Cl 10M MgCl2
限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’ 端为-OH。
限制性核酸内切酶分类
• 识别切割特性 • 催化条件 • 是否具有修饰酶活性
• 至2005年1月，共发现限制酶3681种
– Ⅰ 型59种 – Ⅱ 型3612种 – Ⅲ 型10种
• 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶 中共有 221 种特异性。
2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子 质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不 同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次 为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制 完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用
质粒的提取与酶切实验报告
质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的方法，用于提取和分离特定的DNA 分子或者蛋白质分子。
这些分子通常用于进一步的分析和研究，比如测序、克隆、表达、结构分析等。
质粒提取是指从细胞或组织中提取DNA 的过程。
这通常包括将细胞破碎或消化，然后使用不同的化学方法去除蛋白质、脂质和其他污染物，最后得到纯的DNA。
常用的质粒提取方法有沉淀法、超声法、溶剂法、离心法和酶法等。
酶切实验是指使用酶切特定的序列，将DNA 或蛋白质分割成较小的片段的实验。
常用的DNA 酶有限制性内切酶、全基因组酶和多克隆抗体酶，常用的蛋白质酶有蛋白酶K、蛋白酶D 和蛋白酶R。
酶切实验可用于检测和鉴定特定的DNA 序列或蛋白质分子、研究基因组结构和功能、分离和纯化蛋白质分子等。
在进行质粒提取和酶切实验时，应注意实验条件的控制，包括温度、pH 值、酶的活性和浓度、酶的孵育时间和物质的浓度等。
此外，应注意保护样品的纯度，避免受到污染或酶的抑制。
在进行酶切实验时，还应注意使用适当的酶抑制剂来控制酶的活性，以防止不必要的酶切。
在实验报告中，应详细记录实验条件和步骤，并描述样品的特征和纯度。
对于质粒提取实验，应记录使用的提取方法、提取效率和纯度，并对提取的质粒进行简单的鉴定。
对于酶切实验，应记录使用的酶种类和条件、酶切特异性和效率，并对酶切的片段进行简单的鉴定。
总的来说，质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的基础实验，在进行这些实验时应注意实验条件的控制和样品的纯度，并在实验报告中详细记录实验条件和结果。
实验3 质粒的提取和鉴定,DNA酶切-Li revised
分离质粒DNA的 基本步骤
• 培养细菌使质粒扩增； • 收集和裂解细菌； • 分离和纯化质粒DNA
质粒DNA的提取方法
• 碱变性法（碱裂解法）； • 煮沸裂解法； • 羟基磷灰石柱层析法； • 质粒DNA释放法； • 酸酚法等。
碱变性（裂解）法基本原理：
在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双
开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。
• 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注 意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱
中去沉淀DNA。
DNA的限制性酶切
Plasmid (质粒)
• • • • Plasmid menzyme map
加入溶液II 和III后防止剧烈振荡 ，可能把基因组DNA剪切成碎 片从而混杂在质粒中。细菌培 养时间过长会导致细胞和DNA 的降解，培养时间不要超过16 小时。
提高质粒产量的注意事项
• 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；
• 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核 酸变性； • 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复 性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm， 4℃，离心30sec，弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放 置1分钟。 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定
系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
质粒DNA的制备 限制性内切酶切割重组质粒
朱文博 中山医学院
基因克隆
• 定义：
经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通 常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
基因工程
• 定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为基因工程，又称重组DNA技术。
• 基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
31
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育12h） (3)电泳鉴定（下次实验课内容）
32
2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计
20μl
实验步骤：将10 μl 质粒DNA加入已装有反应缓冲液的 0.2ml EP管，置于已调成37 ℃的PCR仪反应 2h； 余下10 μl DNA保存于-20℃冰箱待做转 化与筛选实验。
变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS
复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
加1.4ml培养物于1.5mlEP管，12000rpm×1min，去上清， 3.3 实 加入冰的200µl 溶液I(保护溶液)，剧烈振荡EP管重悬细菌，室温放置3min 验 加入200µ l 溶液II(高碱)，快速颠倒数次，冰浴3min (不要剧烈振荡！) 步 骤 加入150µl 冰溶液III(高酸)，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min 转移上清500µ l到新EP管，加入等体积500µ l的酚与氯仿/异戊醇的混合物(1:1 混合)，充分颠倒混匀，12000rpm×5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入等体积400µ l氯仿/异戊醇，颠倒混匀， 12000rpm5min 400µ l上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800µ l无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000rpm10min
质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验报告-2015级预防医学-第2实验室
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2015级预防组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2016-12-1 实验地点第二实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1.PCR反应：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链；降低溶液温度使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异。
在pH高达12.6的碱性条件下，细菌线性染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，而质粒DNA大部分氢键也断裂，当pH调至4.8的时候线状染色体DNA片段难以复性而成缠连网状结构，与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起而沉淀，而质粒DNA双链又恢复原状，并溶解于液相中。
3.离心层析柱：硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
4.紫外光吸收法：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，而且物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。
因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。
5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
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2.
菌体老化
碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当
对 策
3.
4.
质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
原 因
1. 2. 3.
1.
混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA
不要使用过多菌体。重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚 等杂质 加入RNaseA室温放臵一段时间
对 策
2.
3.
步骤一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。 （活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37℃振荡 培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30 秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并 重复一次，弃上清，取沉淀。
碱变性法小量提取质粒， DNA的限制性酶切
厦门大学医学院
分子生物学实验教学组
实验目的
• • 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基
因和实验目的选择合适载体与限制性内切
酶，设计构建体外重组分子。
质粒(plasmid)
• 是染色体外能够进行自主复制的遗传单位， 包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和 叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分 子，在基因工程中质粒常被用做基因的载 体。
加入溶液II 和III后防止剧烈振荡 ，可能把基因组DNA剪切成碎 片从而混杂在质粒中。细菌培 养时间过长会导致细胞和DNA 的降解，培养时间不要超过16 小时。
提高质粒产量的注意事项
• 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；
• 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核 酸变性； • 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复 性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分
• 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH， 1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液： 5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
M pBSK pGFP
质粒DNA提取常见问题
问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1.
2. 3. 4.
1.
请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液 的用量 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素 使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，臵于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
分离质粒DNA的 基本步骤
• 培养细菌使质粒扩增； • 收集和裂解细菌； • 分离和纯化碱变性法（碱裂解法）； • 煮沸裂解法； • 羟基磷灰石柱层析法； • 质粒DNA释放法； • 酸酚法等。
碱变性（裂解）法基本原理：
在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双
Attention, please!
• EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时， 应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将 该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！
质粒提取实验材料与试剂
• 实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a • 实验试剂：
– LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL （pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、 氯仿、Rnase、琼脂糖 – TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA – 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0， 新鲜配制）
开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。
• 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注 意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱
中去沉淀DNA。
DNA的限制性酶切
Plasmid (质粒)
• • • • Plasmid map Polylinker Sequence map Restriction enzyme map
原理示意图
质粒DNA电泳
电场中DNA分子的迁移速度取决于：
• DNA分子本身的大小
• DNA分子的空间构型
–超螺旋构型（ccDNA)
–线形DNA(lDNA)
–开链环状DNA(ocDNA)
–复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起)
•溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基 -5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到 核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出 橙色荧光
螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双
螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链 不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，
变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不
能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力 密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合 物等一起沉淀下来而被除去。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm， 4℃，离心30sec，弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。 3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放 置1分钟。 4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。 10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置 5min。室温放置15min干燥。 11．50µl TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 µg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存） 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼 脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
Polylinker (多克隆位点）
Sequence Map
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTT AAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACA ACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCG ATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCG CCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCC ATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACG CAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCA CTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT AAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCG GCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGA CAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAG GCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGG GTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTT CCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCAT CGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCA AACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCC TATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTT AGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCA ACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG TAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCG GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCC GGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCC…… …