抗纤维化基因工程药物研究现状

抗纤维化基因工程药物研究现状

纤维化是导致器官功能慢性衰竭的主要原因，严重危害人类健康。目前临床上仍缺乏可有效逆转纤维化的药物。近年来，随着对纤维化发生机制认识的深入及分子生物技术的不断发展，基因工程药物在抗纤维化治疗中日益发挥重要作用。

[Abstract]Fibrosis is the main cause of chronic organ failure，which is harmful to human beings.There still no effective drugs which can reverse fibrosis in clinic.Recently，with the research on pathogenesis of fibrosis and the development of molecular biological technology，genetic engineering drugs play an important role in anti-fibrosis therapy.

[Key words]Anti-fibrosis；Genetic engineering drugs；Gurrent situation

器官纖維化已成为当今危害人体健康的主要疾病之一，它是以细胞外基质过度沉积为特征的一种病理状态，涉及多种细胞因子、炎症介质和蛋白成分表达的改变，主要与细胞外基质的生成及降解失衡有关[1]。纤维化的持续进展可致器官结构破坏和功能衰竭，严重威胁人类生命健康。纤维化疾病可累及全身多个器官及系统，包括系统性硬化、移植物抗宿主硬皮病、特发性肺纤维化、肝硬化、进展性肾病、心血管纤维化等[2]。虽然目前抗纤维化的药物（细胞因子拮抗剂、胶原生物合成抑制剂和促进胶原分解的抗纤维化药物）取得良好的效果，但由于其制备周期长、造价昂贵等缺点而限制其临床应用。近年来，随着基因工程技术取得巨大进展，以蛋白质的结构与功能间关系为基础，通过周密的分子设计，进而利用基因工程技术来提高重组蛋白的活性，改善产品稳定性，提高生物利用度，延长其在体内的半衰期以及降低制品的免疫原性等优点把蛋白质改造成为合乎人类需要的蛋白质，已成为新药研发的新宠。基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源性DNA（目的基因）和载体DNA重组，最后将重组体转入宿主细胞，使外源性基因DNA在宿主细胞内随细胞的增殖而增殖。

1 Napsin A基因工程药物

Napsin A是一种近年发现的新的天门冬氨酸蛋白酶，主要表达于Ⅱ型肺泡和肾近端小管细胞中，被公认为是肺腺癌的标志物[3]。Napsin A基因含有5个外显子，其转录产物由1263 bp构成，A编码420个氨基酸的蛋白质。Napsin A相对分子量是35 kDa，等电点为5.29，其一级结构是由4部分构成，24个氨基酸残基组成的信号肽，40个氨基酸残基组成的前肽区，336个残基组成的功能区和18个残基组成的C末端[4]，但近年来研究表明其表达水平与肺纤维化密切相关。Samukawa等[5]研究表明，在肺纤维化的患者血清中Napsin A明显增加，提示管血清中Napsin A可作为临床诊断肺纤维化的标志物。Zheng等[6]采用转移质粒、辅助质粒和包膜表达质粒三个部分构建的慢病毒系统PLJM1-Napsin A，将其转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞A549的肺纤维化模型中，结果发现，转染Napsin A基因

的Ⅱ型肺泡上皮细胞A549在上皮-间质转化过程中的增殖能力明显受到抑制，同时，上皮细胞的标志物E-cadherin表达水平下降而间充质细胞的标志物Fibronectin表达增加，可见Napsin A基因工程制品可以有效治疗肺纤维化。

2 细胞球蛋白基因工程药物

细胞球蛋白（Cytoglobin）属于肝星状细胞激活相关蛋白，表达于各种组织的成纤维细胞中。Stone等[7]研究表明，细胞外基质蛋白通过依赖于FAK信号通路来调控Cytoglobin的表达，进而影响纤维化的发生发展；进一步研究表明Cytoglobin能够负向调控肝星状细胞的活化。Mimura等[8]研究表明，过表达Cytoglobin能改善组织的病理变化，保留肾功能和延缓纤维化的发生；同时表明Cytoglobin的这种保护作用与硝基酪氨酸的沉积和尿中羟基脱氧鸟苷的排泄密切相关。He等[9]使用基因工程的方法制备Cytoglobin，研究发现，与对照组比较，在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化SD大鼠模型中，Cytoglobin处理的SD大鼠纤维化程度明显减轻，主要表现在反映肝纤维化等级的重要指标（血浆天冬氨酸氨基转移酶、透明质酸、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白及肝脏羟脯氨酸）的含量均明显降低；同时抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖和促进其凋亡；进一步研究表明，Cytoglobin抑制B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和促进Bax蛋白表达，进而增加了Bax/Bcl-2的比例，提示Cytoglobin通过诱导细胞凋亡途径来在体内外实验中达到抗肝纤维化的目的，可见Cytoglobin基因工程药物代表一种新颖的抗纤维化药物。3 肝细胞生长因子基因工程药物

肝细胞生长因子（HGF）是酪氨酸激酶表面配体受体（c-Met）的有效激动剂，它与分散因子为同一分子，是重要的抗纤维化因子[10]，可介导细胞的生长、存活和运动，对组织的再生发挥有重要作用，但其自身结构复杂，利用哺乳动物表达系统生产重组蛋白的翻译后修饰也很复杂，故哺乳动物细胞培养法制取重组人肝细胞生长因子（rhHGF）产量受到限制并且成本昂贵。Sonnenberg等[11]使用組合蛋白工程法，利用酵母菌系统大量生产出HGF工程片段（HGF-f）作为rhHGF的替代物，这种激动剂二聚体在体外实验显示出与rhHGF类似的功能。研究发现，与对照组比较，过表达HGF-f的心臟细胞中上调基质金属蛋白酶（MMP）-1及MMP-9的mRNA表达，同时下调转化生产因子-β1（TGF-β1）的表达。MMP-1和MMP-9在多种组织中能降解细胞外基质来减轻纤维化，而TGF-β1在超过15种组织中能诱导细胞外基质的表达来增加纤维化，提示HGF 对纤维化疾病具有治疗作用。重组蛋白HGF自身不稳定，能迅速被广泛表达在肝细胞表面和细胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）螯合，这种天然分子同样趋向于聚合。这些特征限制了活化的生长因子的数量，同时也限制了其在临床上的应用。HGF包含2条多肽链和6个结构域：N端结构域（N）、4个具有α重链的环状结构域（K1～K4）和一个具有β轻链的丝氨酸蛋白酶同源结构域，HGF对HSPG有两个结合位点：高亲和力的在N结构域、低亲和力的在K1结构域。NK1是HGF自然生成的剪接变体，编码N结构域和K1结构域，Ross等[12]通过蛋白质工程手段生成了NK1的突变体1 K1（K132E∶R134E），它的K1结构域HSPG低亲和力结合位点通过Lys132和Arg134的反相电荷突变被破坏掉，这改变了K1表面的静息电位。研究显示1 K1工程蛋白和天然HGF 蛋白具有相似的促人初级肝细胞增生和抗凋亡的功能，并且1 K1具有更好的溶