流式检测细胞周期的原理

一．细胞周期的检测

1、原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。（n----2n）

2、我们使用PI来标记DNA。PI的通到是FL2

3、荧光信号的表示方法，有荧光的宽度（W），荧光的高度（H），和荧光信号的积分面积（A）.

我们使用荧光的积分面积（A）来检测细胞周期的变化.因为，即使DNA的含量相同的两个细胞，如果细胞的形状差异较大，荧光信号的高度是不相等的。但是积分面积一定相等。

4.接下来我以二倍体细胞为例降解，流式检测细胞周期的过程。

首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有G1期，S期,G2期和M期。我们来分析下各个时期DNA含量的变化。G0期DNA数目为n.

G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成, DNA数目为n.

S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目从n变为2n.

G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2n

M期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n.

从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，s期，G2/M期.

我们利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果G0/G1期处于50的位置，那么G2/M期处于100的位置。期间的为S期。

4、但是有个问题值得我们注意。

我们的样本很容易聚集有时候两个G1期的细胞会聚集在一起形成粘连体，通过激光照射区时，其荧光强度会和G2期的相同，这就需要排除粘连体。我们BD公司的专利技术可以使粘连体通过检测区的荧光宽度比G2期的长。我们利用W对A的散点图分析，如果G0/G1期在50的位置，那么G2/M期在100的位置，其他的位置为粘连体和一些不符合检测的细胞及碎片等。

我们通过画门来得到我们需要检测的细胞。

5、因此我们需要三个图就可以检测到我们的细胞周期变化情况，

第一个散点图，通过前向和侧向的变化，区分出我们要检测的细胞群。第二个散点图我们出去粘连体。第三个直方图得到我们的细胞周期变化。

注意我们这里标FL2是因为我们用的是PI染料。

6、下面是我们的试剂使用的原理，我们的细胞周期试剂盒有三种液体。

A．起固定破膜的作用。因为我们使用的是PI 染料无法过膜；

B．起除去RNA，因为我们的PI染料既能染RNA也能然DNA。

C．液就是PI

7、接下来是我们的一个实验步骤，我们使用的是外周血，首先通过裂解除去红细胞，裂解液

10min. 1200r，5min. 沉淀的是我们需要的细胞。接下来是用鞘液，我们平时做实验的时候可以用PBS，洗我们的细胞。然后，离心获得我们需要的细胞。加A(250)固定破膜，加B液200除去RNA。然后加C液200染色。要注意的是，A液是250ul.B液和C液是200.还有加C 液后要避光。最后要300目过膜。

二、HLA-B27分析

利用试剂盒，首先看样本的制备，

1.50ul的外周血，加A液30ul（包含FITC标记的抗HLA-B27抗原的抗体和PE标记的CD3抗体和人类的T淋巴细胞特异性的结合），然后加血。避光（10min）

2、加B液，10X的细胞裂解液，使用前稀释到1X，2ml避光静止10min.裂解红细胞，立即低速离心。注意不要超过12min。以免破坏白细胞，1200r/5min,去上清

3.加鞘液2ml，混匀洗涤细胞一次,1200r/5min,去上清.

4.加500ul-1ml的鞘液，悬浮细胞，上机

三、四色实验，

1、以两色为例，需要一个单阴管和两个阳性对照以及一个样品管，单阴管用于阴性对照。单阳管用于调补偿，

2、阴性管，100ul血（调电压和域值）

3、单阳管，100ul的血+CD4FITC 10ul

4、单阳管，100ul的血+CD8PE 10ul

5、样品管，100ul的血+CD4FITC 10ul+CD8PE 10ul---避光15min.--2ml裂解液避光10min.1200/5min去上清，2mlpbs洗细胞，1200/5min去上清，加500ulPBS混匀-上机，

四、TBNK(MutiSET)(占不清楚)

1、绝对计数管，准确加入MutiSET试剂10ul和50ul全血，避光15min,要注意，吸取血样的时候，和平时用枪相反，二档吸，应当放。450ul裂解液10min避光，上机（免清洗）

2、