酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化
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酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化
组员：王应龙 王英刚 王志军 吴晓庆 武正芳
2012年1来自百度文库月
【实验目的】
1、了解和掌握乳酸菌菌的菌种特性
2、掌握乳酸菌的分离检测及纯化方法
【实验原理】
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革 兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运 动。菌体常排列成链。根据细胞形态为球状或杆状，可分 为两大类，即乳酸链球菌族（Streptococceae）和乳酸杆 菌（Lactobacilleae）。 在1.6%溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大 约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰 白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。 乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。
匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振
摇均匀，即为10-1的样品稀释液。 将7只装9ml无菌水的无菌试管，依次编号1--7，再用无菌移液管 吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管1--6中，稀释混匀 便得到10-2～10-7的稀释液。
酸奶菌悬液的配制
10ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
10-1
花园酸奶 90ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
革兰氏染色结果为蓝紫色，证乳酸菌为革兰氏阳性菌
3、脱脂乳试管检测乳酸杆菌
试管中脱脂牛乳凝固，证为乳酸杆菌
4、初步结果
通过实验，我们可以得出如下结果： 酸奶中乳酸菌称杆状或排成链状，乳酸菌菌落大 约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或 暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO的溶解圈。革兰 氏染色后呈蓝紫色为阳性菌。脱脂乳试管牛乳凝固。
【实验材料、仪器与试剂】
实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水
【实验步骤】
1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备
2、脱脂乳试管的制备
B．平板涂布
用无菌移液管分别吸取10-5、10-6、10-7和无菌生理
盐水的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的无菌溴甲 酚紫牛乳培养基平板中；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平 板上涂布均匀，平放于试验台上20 min；然后倒置于40℃ 恒温箱中培养48小时。
（4）、乳酸菌的检测、纯化培养
(1)、初步检测
请老师批评指正，谢谢！
3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养
（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备
配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g ，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水 量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加 热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形 瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板。
培养8-24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂
片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，
则可将其连续传代3次，最终选择出在3-6h能凝固
的牛乳管，作菌种待用。
【注意事项】
采用溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板筛选
乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，
结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
【结果与分析】
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布
较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌
菌落。乳酸菌的菌落很小，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙， 在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈，如出现圆形稍扁 平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
（2）、乳酸菌的分离纯化培养
选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃
（2）、脱脂乳试管的制备
直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10g与蔗
糖5g，水95g（蔗糖与水的比例在1：10的范
围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，
115℃灭菌15min。
（3）、乳酸饮料或酸奶中乳酸菌的分离
（1）、酸奶菌悬液的配制
取1个洁净三角瓶，盛以90ml无菌水；7支试管，各盛9ml的无菌水； 加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 将酸奶样品搅拌均
1、接种不同浓度菌悬液培养基中乳酸菌落数
稀释度 平板 1 10-5 2 3 1 146 10-6 2 3 1 85 10-7 2
84
CK对照 3
73 2
1
3
2
3
3
菌落数
263 245 281 161
140 138 97
各浓度平 264 均菌落数 平均菌落 数（减去 CK后）
3
1.46X10-7
2、革兰氏染色结果
组员：王应龙 王英刚 王志军 吴晓庆 武正芳
2012年1来自百度文库月
【实验目的】
1、了解和掌握乳酸菌菌的菌种特性
2、掌握乳酸菌的分离检测及纯化方法
【实验原理】
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革 兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运 动。菌体常排列成链。根据细胞形态为球状或杆状，可分 为两大类，即乳酸链球菌族（Streptococceae）和乳酸杆 菌（Lactobacilleae）。 在1.6%溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大 约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰 白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。 乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。
匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振
摇均匀，即为10-1的样品稀释液。 将7只装9ml无菌水的无菌试管，依次编号1--7，再用无菌移液管 吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管1--6中，稀释混匀 便得到10-2～10-7的稀释液。
酸奶菌悬液的配制
10ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
10-1
花园酸奶 90ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
革兰氏染色结果为蓝紫色，证乳酸菌为革兰氏阳性菌
3、脱脂乳试管检测乳酸杆菌
试管中脱脂牛乳凝固，证为乳酸杆菌
4、初步结果
通过实验，我们可以得出如下结果： 酸奶中乳酸菌称杆状或排成链状，乳酸菌菌落大 约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或 暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO的溶解圈。革兰 氏染色后呈蓝紫色为阳性菌。脱脂乳试管牛乳凝固。
【实验材料、仪器与试剂】
实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水
【实验步骤】
1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备
2、脱脂乳试管的制备
B．平板涂布
用无菌移液管分别吸取10-5、10-6、10-7和无菌生理
盐水的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的无菌溴甲 酚紫牛乳培养基平板中；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平 板上涂布均匀，平放于试验台上20 min；然后倒置于40℃ 恒温箱中培养48小时。
（4）、乳酸菌的检测、纯化培养
(1)、初步检测
请老师批评指正，谢谢！
3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养
（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备
配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g ，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水 量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加 热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形 瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板。
培养8-24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂
片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，
则可将其连续传代3次，最终选择出在3-6h能凝固
的牛乳管，作菌种待用。
【注意事项】
采用溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板筛选
乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，
结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
【结果与分析】
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布
较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌
菌落。乳酸菌的菌落很小，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙， 在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈，如出现圆形稍扁 平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
（2）、乳酸菌的分离纯化培养
选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃
（2）、脱脂乳试管的制备
直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10g与蔗
糖5g，水95g（蔗糖与水的比例在1：10的范
围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，
115℃灭菌15min。
（3）、乳酸饮料或酸奶中乳酸菌的分离
（1）、酸奶菌悬液的配制
取1个洁净三角瓶，盛以90ml无菌水；7支试管，各盛9ml的无菌水； 加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 将酸奶样品搅拌均
1、接种不同浓度菌悬液培养基中乳酸菌落数
稀释度 平板 1 10-5 2 3 1 146 10-6 2 3 1 85 10-7 2
84
CK对照 3
73 2
1
3
2
3
3
菌落数
263 245 281 161
140 138 97
各浓度平 264 均菌落数 平均菌落 数（减去 CK后）
3
1.46X10-7
2、革兰氏染色结果