病原菌分离培养总结

病原菌的分离培养方法
一、基本原理
植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。

为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。

最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）
1.分离的准备工作
（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。

背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。

（2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板；
（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。

2.组织分离法
（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；
（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。

（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。

腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑
点病害应在临近健全组织的部分分离。

）
（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌
操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植
物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌
水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。

（5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。

（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的
水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。

（6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养。

一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要
分离的病原菌。

（7）除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；
（8）在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得
该分离病菌纯菌种，便可保存。

三．病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例）
1.分离的准备工作
（1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。

主要危害叶和根。

幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。

叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变"V"字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。

病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。

萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色；重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同。

（2）培养基的准备:PDA，后划线纯化NB；
（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70％酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

2.黑腐病菌分离
（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；
（3）取萝卜黑腐病块茎，用75 %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块（2mm*3mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。

（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。

（4）将培养皿倒置放人28 ℃左右恒温箱内培养。

一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。

（5）根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落（黄、红、生防），分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28℃左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。

（6）观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不整齐。

四．资料查询其他分离培养方法
1.病原真菌
稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。

(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。

(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。

(4)将熔化开冷却到45～50C的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。

提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离
失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。

为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50C。

(5)将培养皿翻转后置恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。

(6)挑菌。

将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25℃左右培养。

待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。

2.病原细菌
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。

在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。

稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。

除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：
(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30C恒温箱中2—4h，使表面无水滴凝结。

也可凝成平板后直接使用。

(2)将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20—60min，让细菌释放到灭菌水中。

(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。

划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。

灭菌后再划第三次线。

提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。

(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28C恒温箱中培养。

1—3d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。

(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。

同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。

最好要经过连续
三次单菌落的分离，才能确保纯化。

五．常用的几种典型的病原菌分离方法
1．斑点病原菌的分离。

从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离。

从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离。

根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。

材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离。

多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离。

将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法。

能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7．土壤带菌分离法。

为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。

分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。