病原菌分离培养总结

病原菌的分离培养方法

一、基本原理

植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

二．病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）

1.分离的准备工作

（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。

（2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板；

（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。

2.组织分离法

（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；

（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。

（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。

腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑

点病害应在临近健全组织的部分分离。）

（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌

操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植

物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌

水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。

（5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的

水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。

（6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要

分离的病原菌。

（7）除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；

（8）在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得

该分离病菌纯菌种，便可保存。

三．病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例）

1.分离的准备工作

（1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。主要危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变"V"字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色；重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同。

（2）培养基的准备:PDA，后划线纯化NB；

（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70％酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

2.黑腐病菌分离

（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；

（3）取萝卜黑腐病块茎，用75 %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块（2mm*3mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。

（4）将培养皿倒置放人28 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。

（5）根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落（黄、红、生防），分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28℃左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。（6）观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不整齐。

四．资料查询其他分离培养方法

1.病原真菌

稀释分离法

(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。

(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。

(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。

(4)将熔化开冷却到45～50C的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。

提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离