生物表面活性剂

它们主要是利用碳氢化合物的微生物产生，通过生物表面活性剂的作用使碳氢化合利用吸

收

生物表面活性剂发酵条件的优化、提取与分析

摘要：生物表面活性剂是由微生物产生的具有高表面活性的生物分子。相对于化学合成的表面活性剂,生物表面活性剂对生态系统的毒性较低,且可生物降解。它可以应用在如采油和能源工业、药物和化妆品、食品、环境工程等各个工业领域。本文讲述了生物表面活性剂从生产菌的筛选到培养条件的优化以及生物表面活性剂的提取的全过程。从污水、污泥样品中经过富集培养、血平板分离、摇瓶培养和排油活性测定等方法筛选筛选出了可以产生生物表面活性剂的1株细菌和2株酵母菌，并对其中的1株酵母菌的发酵条件如碳源，氮源，初始pH值，溶氧量这些分别进行单因素优化的讨论，并通过萃取的方法得到生物表面活性剂产物。

关键词：生物表面活性剂，筛选，发酵，优化，提取

Abstract：Biosurfactant is a high surface-active agent synthesized by microorganism. Compared with themical surfactant, biosurfactant has a low toxicity to ecological system of Earth. The applications of biosurfactants in some fields such as enhanced oil recovery, energy industry, pharmaceuticals and cosmetics, food and environmental control are presented. This review is made from several aspects: screening of biosurfactant-producing microorganism, optimization of culture brooth, isolation of biosurfactant. Microorganisms capable of producing biosurfactants can be isolated by a series of steps including hydrocarbon enrichment culture, hemolytic activity assay on blood agar plates and oil displacement activity assay etc. the strains were isolated from waste soil and waste water. We screen one strain of bacteria and two strains of yeasts.

Keywords: Biosurfactant, screening, fermentation, optimization, isolation

1 引言

1．1 生物表面活性剂的概述

概述生物表面活性剂的产生、分类、特点以及应用。

1．2 生物表面活性剂的生产

微生物制备生物表面活性剂基本上还是可以主要分为培养发酵、分离提取、产品纯化三大步骤[17]。产生生物表面活性剂的微生物大多数生长在油含量较高的地方，可在富油环境下筛

选出。生物表面活性剂的发酵条件，生产技术的改善已使生物表面活性剂的生产效率和使用效率有了很大的提高，应对经济可行性为方向进行研究。开发出简单高效的生物表面活性剂提取技术，降低生产成本也是使生物表面活性剂得到普及的重要因素，在目前的工业技术上还是有一定的难度。

1．3 生物表面活性剂的发展前景

无论在应用上，还是在环保上，生物表面活性剂的所有特性均超过了化工合成的表面活性剂。可以相信，生物表面活性剂的生产一定可以得到普及，并且在很快的时间内，可以超过化工合成的表面活性剂，而且最后完全取而代之。

2 试验器材和方法

2．1 试验菌种

试验菌种为不同种类的细菌，酵母和霉菌，均来自所采集的废水，污泥中。以下列出的

为废水，污泥出处：a XX化工炼油厂；b XX四季青废水处理厂。

2．2 试验药品和试验仪器

2．2．1 试验药品

2．2．2 培养基配方

（1）富集培养基：a 细菌富集培养基，正己烷在临用时无菌操作加入；b 酵母和霉菌富集培养基，正己烷在临用时无菌操作加入。（2）血平板培养基：羊血随用随加，不能进行灭菌。（3）斜面培养基（4）鉴别培养基：a 酵母鉴别培养基（Czapek培养基）；b 霉菌

鉴别培养基（Martin琼脂培养基），临用前加入0.03%链霉稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30µg。

2．2．3 试验器材和设备

2．3 试验原理与方法

2．3．1菌种的筛选

（1）菌种的来源与培养

产生生物表面活性剂的微生物一般是在富油条件下生长的，可以在一般城市的化工厂的排出废水中或是处理民用的污水处理厂里获得这些菌种。对其进行细菌和酵母还有霉菌富集培养。

（2）菌种的选择

通过菌种是否具有溶血性来判断该菌种是否可以产生生物表面活性剂。因为产生生物表面活性剂的菌种有很强的抗菌溶菌作用，它可以将血琼脂平板上的血细胞水解，使菌落的周围产生明显的透明环。方法是：将菌种划线接种至血平板上，培养后若长出具有溶血现象的菌落，即为可能产生生物表面活性剂的菌种[20]。对其进行扩培纯化。

（3）优良菌株的筛选

比较它们之间的表面张力，可以通过比较发酵液的排油直径来得到结论。原理是：排油直径的大小与产物的含量和活性成正比。排油直径测定的方法是：取一培养皿，加水，水面上加

0.1ml正烷烃形成油膜。在油膜中心加去杂发酵液（去杂方法见产物的提取），中心油膜被挤向四周形成一圆圈。圆圈直径大于3cm的菌株保留作进一步的研究[20]。

（4）镜检

a 细菌的镜检：采用Gram氏染色法。

b 真菌的镜检：使用活体染色法。

2．3．2 发酵条件的优化

具体方法如下：采用单因素的优化的方法，分别对发酵液的碳源，氮源，初始PH，溶氧量，微量元素的种类进行替换，通过比较产物间的表面张力来得出最佳配方[18，21]。表面张力的测定即测定排油直径，最后选取排油直径最大的条件定为最优的发酵条件。

（1）分别用不同的碳源来代替正己烷来制备发酵液：玉米浆，葡萄糖，以及植物油。

（2）分别用不同的氮源来制备发酵液：蛋白胨，牛肉膏以及尿素。

（3）分别采用为5.0，6.0，7.0，8.0和9.0的初始pH值进行发酵培养。

（4）不同的转速对溶氧量进行控制，分别采取用160r/min，120r/min以及无振摇的温箱培养作为对比。

（5）采用不同的发酵温度来进行摇床发酵培养进行对比。选用28℃和37℃。

2．3．3 产物的提取

（1）发酵液除杂。发酵液进行离心，转速6000r/min，两次，取上清液，加入丙酮，剂量为发酵液的3倍，摇匀，放置半小时，再进行离心，转速6000r/min，离心一次，取上清液，蒸去丙酮。

（2）对去杂发酵液进行萃取。采用V氯仿：V甲醇=2：1作为萃取剂，剂量为去杂离心液的3倍，萃取3次[20]，每次静置12小时，取下清液。

（3）进行70℃水浴蒸去萃取剂，蒸干得产物。

（4）重量法称重。先称取蒸馏产物用烧杯的净重，然后称取烧杯加产物的重量，减去烧杯的重量，即为产物重量。

3 试验步骤

3．1 菌种的筛选

3．1．1 样品采集

表1 样品的出处