猪流感病毒分子生物学研究进展

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分子生物学的新研究进展

分子生物学的新研究进展分子生物学是一门研究生命体的分子结构、组成和功能的学科，是现代生物学的一个重要分支。

近年来，随着人们对分子生物学的认识和技术的不断发展，我国分子生物学的研究水平也得到了大幅提高，取得了一系列重要的新成果，本文将就此展开讨论。

一、基因编辑技术的突破基因编辑技术是近年来分子生物学领域一项重要的进展，其研究旨在通过改变、加强、削弱、甚至“修补”人类或其它生物体的基因，来治疗某些遗传性疾病。

而在2018年，浙江大学研究团队发现了一种依赖于CRISPR-Cas9系统的新型基因编辑技术，该技术可以快速、高效地改变细胞的DNA序列，并且相对于其他基因编辑技术来说，这种新型技术具有更为准确的编辑能力，可以避免出现意外效应。

二、RNA研究引发新的学术争议RNA是一种重要的生物分子，最初主要被认为是DNA的“过渡产物”，但是随着技术的发展和研究的深入，我们发现RNA在生命体内的调控、转录和翻译过程中发挥着重要的作用，甚至可能掌握着某些疾病的发生机制。

然而，近年来，一项名为“CelI-Seq”的研究却对RNA在基因转录中所扮演的角色提出了质疑，并且引发了学术争议。

该研究员发现，许多RNA并不是由基因转录而来，而是通过RNA后转录和RNA碎片的剪切修建而成，这意味着RNA的生物学功能并不一定与DNA密切相关。

这一结论也颠覆了许多分子生物学家之前的认知，引起了一场有关RNA研究的深度讨论。

三、新型药物研发开辟新的疗法2019年，复旦大学的研究团队成功开发出一种基于指求和RNAi技术的抗肿瘤药物，该药物可以兼备杀死肿瘤细胞的效果，同时又不会令正常细胞受到影响，具有较大的潜力用于未来的临床治疗。

相比于其他抗肿瘤药物，该药物更为安全、有效，而且可以根据患者的基因特征进行个性化调整和治疗。

总之，随着科学技术的发展和研究的深入，分子生物学领域的新进展不断涌现，这些进展必将推动医学疗法的发展以及人类的生存环境改善。

禽流感病毒致病机制的研究进展

文献综述禽流感病毒致病机制的研究进展摘要：禽流感对畜禽养殖业造成巨大经济损失，并对人类健康造成威胁，已成为各国公共卫生关注的人畜共患病。

本文从禽流感病毒（Aｖiａn Ｉnｆｌuenza Vｉruｓ .AＩＶ）的分子学特性,跨越种属的传播机制以及各基因组份与致病性的作用等方面进行简述。

关键词：禽流感病毒;传播机制;致病机制1前言禽流感(ＡviaｎInfluenza．AＩ）是由正粘病毒科A型流感病毒(Avian Inｆluenza Ｖｉrus. AIV)引起的禽类急性传染病，被世界动物卫生组织和我国《家畜家禽防疫条例》列为A类烈性传染病。

禽流感病毒根据其核蛋白（NＰ)和基质蛋白(Ｍ1）抗原性及其基因特性的不同可划分为A、B、C型。

其中Ａ型流感病毒感染范围最广、危害最大,常以流行性的形式出现,并能引起世界性人流感的大流行。

Ａ型流感病毒也可以从各种动物体中分离到,例如人、猪、马、海洋哺乳动物、猫、狗和鸟类等[1]。

根据对鸡致病性的不同，AIV可以分为高致病性禽流感（Hｉｇhly PathoｇeniｃＡviaｎInfluｅnzａ.HPAI）和低致病性禽流感（Ｌow PathoｇenｉｃAviａn Iｎflｕenｚa.ＬＰAI)。

高致病性AＩV 由于其传染性极强，可引起家禽全身性感染，造成多个组织器官严重病理损伤,致死率达１０0%，其感染禽类达88种,主要是鸡、鸭、鹅，除此之外,还可感染猪、猫、狗、老虎等哺乳动物和人类，是一种人畜共患病,对各国的公共卫生构成严重的危害［2]。

近年来不断增加的H5N1亚型禽流感病毒（AIV)直接感染人、致人死亡的事件不断增加。

本文对禽流感病毒致病机制的研究进展综述如下,以期提高人们对公共卫生学意义上禽流感防控紧迫性的认识。

２AＩV生物学特征流感病毒属正黏病毒科，是一种呈球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒,其基因组分为8个节段,编码血凝素（hemaｇglｕtiｎｉｎ,HA）)，神经酰胺酶（neuｒａminidaｓｅ, NA）,基质蛋白(mａtrｉx protein,M)M1和离子通道M２,非结构(ｎoｎsｔructｒuaｌ，NＳ）蛋白NS1和NＳ2，核蛋白(nucleo protein，NP）以及三个聚合酶PB1、PB２(polymｅrａse basic１，2）和PA(ｐｏlyｍerasｅaciｄiｃ）以及新发现的与有道细胞凋亡有关的ＰB1－F2蛋白［３]等10种蛋白。

前沿分子生物学研究进展

前沿分子生物学研究进展近年来，随着科技的发展和人们对健康的关注，分子生物学的研究受到越来越多的关注。

分子生物学是研究分子和细胞的结构、功能和相互作用的学科。

在科学研究发展的过程中，前沿研究始终是人们关心的焦点。

本文将对当前分子生物学研究的一些前沿进展进行介绍和理解，以期能更好地了解生命的奥秘。

一、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，它是一种有着广阔潜力的DNA切割和粘贴技术，基于细菌免疫系统提供的抗病毒保护机制。

“CRISPR”指的是“集群间重复意义短回文序列”(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，而CAS-9则是能够识别和切割DNA的酶。

CRISPR-Cas9技术可以使科学家更准确、更快速地编辑人类或者其它物种的基因。

它可以修复或删除基因，对于研究基因的功能以及治疗人类遗传病具有重要意义。

该技术目前已在许多生物领域得到广泛的应用，比如增强了抗病作物的培育，改善人类遗传缺陷的治疗等。

虽然这种方法仍处于研究阶段，但它的发明已经引起了世界范围内科学家的广泛关注和研究。

二、免疫治疗免疫治疗是一种新型癌症治疗方法，它是通过激发人体免疫系统来打击癌症。

这种新型治疗方法通过改变T细胞的活性、激活其免疫系统，让免疫系统自主对抗肿瘤。

近年来的研究成果表明，免疫治疗可以生成持久性的免疫反应，增加细胞因子的产生，提高肿瘤细胞的毒性，使得免疫系统能够更有效地攻击癌症。

这种治疗方法已经在良性和恶性疾病的治疗上有了重要的影响，其中最有希望的是在癌症治疗领域，免疫治疗被认为是最有潜力的救命稻草之一。

三、DNA合成人类DNA合成的观测和研究已经超越了以往的常规技术，比如PCR(聚合酶链式反应)，随着更多技术的开发，大量的待测序列正在处理中，并且更易于解读。

现在人们可以比以往任何时候都更准确地合成DNA序列。

这种DNA合成技术为新型药物的发展和基因工程的更深入研究提供了可能。

猪流感的发病特点及综合防控

猪流感的发病特点及综合防控作者：王俊杰王华丽安然来源：《中国动物保健》2023年第11期摘要：猪流行性感冒是由A型流感病毒引起的猪的呼吸道疾病，该病作为猪群的临床常见疾病，在世界范围内广泛流行。

本文结合最近几年的研究成果对猪流感的病原学、发病特点、诊断方法及防治措施进行了综述，以期能为广大养殖户提供参考。

关键词：猪流行性感冒；发病特点；诊断；防治措施猪流行性感冒（swine Influenza，简称猪流感）是由A型猪流感病毒（SIV）引起的猪的一种高度接触性传染病，该病发病率高，传播速度快。

猪流感病毒一年四季都可以在猪群中传播，但以秋冬初春等寒冷季节多发，与人类的暴发相似。

该病毒通常不会感染人类，但已经发生了罕见的人类感染。

虽然该病对猪的致死率不高，但可引起母猪流产、产死胎等繁殖障碍症状，导致育肥猪继发细菌病，影响育肥猪的死淘率及料肉比。

目前，对于该病尚无特效药物，主要以预防为主，辅以药物进行对症治疗。

为有效减少猪流感造成的危害，本文结合最近几年的研究成果对猪流感的病原学、发病特点、诊断方法及防治措施进行了综述，以期能为广大养殖户提供参考。

1 猪流感概述1.1 病原学特征猪流感病毒属正粘病毒科成员，是由8个大小不等的RNA基因片段组成的球形颗粒，直径约在20～120 nm之间，大小不一[1]。

8个不同基因片段分别编码不同的免疫球蛋白，猪流感病毒是引起猪严重呼吸道疾病的主要病原之一。

在3种（ A、B、C）中，只有A型流感引起猪发病。

也就是说，该病毒有很多毒株，根据病毒包膜表面的血凝素（ H或HA）和神经氨酸酶（ N或NA）糖蛋白的性质进行亚型划分。

与人类和其他动物中的流感病毒一样，猪流感病毒也在不断变化。

猪可以感染禽流感和人流感病毒以及猪流感病毒。

当来自不同种属的流感病毒感染猪时，病毒可以基因重配（即互换基因），也可以出现猪、人和/或禽流感病毒混合的新病毒。

多年来，猪流感病毒出现了不同的变异。

其中A、B、C流感病毒分型主要依靠节段5编码的核蛋白，抗原性差异获得；H1N1、H1N2和H3N2等不同亚型的划分，主要根据节段6编码的神经氨酸酶和血凝素两个表面糖蛋白抗原性差异进行確定[2]。

三株H1N1亚型猪流感病毒M基因序列测定与进化分析

猪流感，是集约化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之一，也是世界上最常见的猪传染病之一，目前有10种血清亚型。

H1N1亚型SIV在中国日趋复杂和多变，与其他亚型流感病毒密切相关，并在其他谱系之间发生多重重组，其中基质蛋白位于流感病毒第7段，含有1 027个核苷酸，具有M1和M2两个相互重叠的编码区。

本试验通过对三株H1N1亚型SIV的M基因进行鉴定分析，为进一步防控猪流感病毒的流行和进化情况提供资料。

1 实验材料1.1 材料广东清远某养猪场采集的具有流感症状的猪的猪鼻腔拭子，置于－80℃冰箱保存。

SPF（无特定病原体）鸡胚购自广东新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。

基因工程菌为E.coil DH5α，感受态（T a KaRa，日本）；常规克隆T载体是pMD19-T Vector （T aKaRa，日本）。

1.2 实验相关试剂、试剂盒、培养基Ex T aq®（Catalog No. DRR001A）、dNTP Mix-ture（Catalog No. D4030RA）、pMD®19-T Vector （Catalog No. D102A）、E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit （Catalog No. D2500-01），E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I（Catalog No. D6943-01）：（Omega公司产品）。

RNase inhibitor（T aKaRa，日本）、DNase Ⅰ（T aKaRa，日本）、Surface RNase Erasol（北京天恩泽基因科技有限公司，中国）、FastStart SYBR Green Master (Rox)（Roche，瑞士）、RNAiso Plus RNA提取试剂（Catalog No. D9108A）、PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver. 2（Catalog No. DRR055A）。

病毒学发展的历史与现状

病毒学发展的历史与现状病毒学是一门关于病毒这种微生物的研究学科，其中包括病毒的结构、生命史、致病性以及机理等多方面的内容。

以及病毒在免疫和疾病的治疗方面的应用。

在这篇文章中，我们将探讨病毒学的发展历史，并对当前病毒学的现状进行归纳总结。

病毒学发展的历史病毒学的起源可以追溯到19世纪，当时人们已经知道病菌可以引起疾病，但是一些无法被细菌发现的病毒也存在，并且可以引起人类和动物的疾病。

1892年，德国科学家德梅斯特·朱雷克（Demetrius Zhdreeck）首次发现了人类猪流感病毒。

1900年，美国教授华莱士·杨默博士使用普通过滤技术将病原体过滤出来，并成功验证了病毒的存在。

20世纪初，人们对病毒的研究越来越深入。

1915年，德国科学家理察·雅克比（Richard Jakob）在印度孟买分离了强制性流感病毒，并证明了该病毒可以引起牛和小鼠的疾病。

随着德国科学家弗里德里希·洛夫勒和彼得·罗斯滕的贡献，生产疫苗成为可能。

1940年代，电子显微镜相继问世，使科学家们能够直接观察到病毒的形态结构。

1952年，人类获得了对于小儿麻痹症病毒的控制。

1970年代至1980年代初期，病毒学家们逐渐发现了世界上第一次人性免疫缺陷病毒（HIV）和埃博拉病毒。

此后，病毒学家利用这一知识，开发了多种疫苗，可以有效预防世界各地的病毒感染。

病毒学的现状在新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的全球爆发之后，病毒学再次成为了许多人们关注的重点。

据统计，COVID-19已经在全球范围内感染了数百万人，并造成了数十万人的死亡。

尽管冠状病毒的研究得到了突破性进展，但是科学家们仍在努力寻找有效的治疗方法和疫苗。

在这个过程中，病毒学的学科范围也得到了进一步扩展。

现代病毒学的新兴领域包括：1.分子生物学：通过研究病毒的基因组成和结构，学习病毒的复制和进化机制。

2.病毒遗传：研究病毒遗传的方法和机制，以发展新的治疗和预防策略。

猪流感病毒的基因结构和进化分析

猪流感病毒的基因结构和进化分析猪流感，又称豬流感或豬人流感，是一种由猪流感病毒引起的传染病。

它具有高度的传染性和致病性，并且可以通过空气传播给人类。

这种病毒可以感染人类、猪和其他动物，因此被视为全球公共卫生问题。

为了更好地应对猪流感病毒的威胁，我们需要对它的基因结构和进化机制有一个全面的了解。

猪流感病毒的基因结构猪流感病毒是一种RNA病毒，其基因组约有14.8kb，包含了八个片段。

这八个片段分别编码了HA（衣壳蛋白）、NP（核心蛋白）、NS（非结构蛋白）、M1和M2（矩阵蛋白）、PA（辅助蛋白）、PB1和PB2（催化蛋白）等重要蛋白质。

这些蛋白质在病毒的生命周期中扮演着重要的角色，如为病毒包裹提供支持、负责病毒的复制等。

猪流感病毒的进化机制猪流感病毒在不同种类之间的传播是一个众所周知的问题。

尤其是当它在人类中传播时，可能会导致全球性流行病。

因此，了解猪流感病毒的进化机制非常重要。

研究表明，猪流感病毒具有较高的变异性，如Haemagglutinin（HA）是病毒的一个关键蛋白，其可以被人类免疫系统识别，从而导致病毒的抗原性改变。

此外，病毒的基因重新组合也是其进化的重要推动力之一。

一个有趣的事实是，猪流感病毒的基因组是由多种不同的病毒来源组成的。

例如，它可能是由猪、鸟和人类体内的流感病毒相互作用而形成的。

这种基因重新组合可以导致病毒的升级，从而使其更加具有威胁性。

猪流感病毒的进化分析最近的一项研究表明，猪流感病毒的进化速度非常快，大约每年会出现10-20%的基因变异。

这是由于其基因多样性和快速的传播速度，使其在短时间内适应不同环境的压力。

因此，对猪流感病毒进行更深入的进化分析是非常必要的。

通过对不同病毒株之间的比较，科学家们发现，可以将猪流感病毒分为三种类型：经典型、欧亚型和北美型。

这些不同的类型具有不同的毒力和传播模式。

其中，北美型病毒在2009年爆发了大规模的猪流感全球传播，并被称为H1N1病毒。

猪支原体肺炎治疗与预防的研究进展

1072016年33卷第10期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学加康—有效控制呼吸道疾病22才能灭活完全[8]，因此对比来看，在以后制备乙脑灭活疫苗过程中，选用3% H 2O 2灭活JEV，能够大大节约时间成本。

本研究还显示2%甲醛37 ℃灭活病毒36 h 灭活完全，甲醛灭活苗作用细胞后，细胞出现脱落，状态变差，继续传代没有检测到JEV，可能是残留的甲酸对细胞有毒性。

这也表明H 2O 2相较于甲醛作为灭活剂的优势，灭活产物没有残留，以此制备的灭活苗更安全稳定。

参考文献[1] 蔡宝祥.我国流行性乙型脑炎研究近况[J].畜牧与兽医,2012, 44(7): 1-5.[2] DELGADO M F, COVIELLO S, MONSALVO A C,et al. and sufficient for protection against monkeypox virus[J]. Nature medicine, 2005, 11(7): 740-747.[6] PINTO A K, RICHNER J M, POORE E A, et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice[J]. Journal of virology, 2013, 87(4): 1926-1936.[7] ABD ELGHAFFAR A A, ALI A E, BOSEILA A A, et al. Inactivation of rabies virus by hydrogen peroxide[J]. Vaccine, 2016, 34(6): 798-802.[8] 李朋. 日本脑炎病毒样颗粒疫苗及双氧水灭活疫苗的探讨性研究[D].南京：南京农业大学, 2013.(收稿日期：2016-09-08)猪支原体肺炎治疗与预防的研究进展常鑫(贵州大学药学院，贵州贵阳 550000)猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病，又称猪气喘病、猪霉形体肺炎（Mycoplasma Hyopneumoniae, Mhp）和猪地方流行性肺炎（Enzootic pneumonia of pigs）[1]。

猪流感与猪感冒在兽医临床上鉴别和治疗

猪流感与猪感冒在兽医临床上鉴别和治疗猪流感和猪感冒是两种常见的猪类呼吸道疾病，它们在兽医临床上的鉴别和治疗对于猪的健康和养殖产业的发展至关重要。

本文将重点讨论猪流感与猪感冒在兽医临床上的鉴别和治疗方法。

一、病因与症状猪流感是由猪流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要病因是由A型猪流感病毒感染引起。

患病的猪呈现出高热、咳嗽、流涕、厌食、精神萎靡等症状，严重影响了猪的生长和养殖效益。

二、鉴别诊断猪流感和猪感冒在临床上症状有所相似，但由于病原体的不同，在鉴别和诊断上还是有一定的区别。

1. 病原体鉴别：猪流感主要由A型猪流感病毒引起，而猪感冒则是由猪传染性鼻炎病毒引起，通过病原体的分离鉴定，可以明确病因。

2. 临床症状鉴别：猪流感的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕等，而猪感冒的症状主要为打喷嚏、流涕、鼻部炎症等。

通过对照症状和临床表现，可以初步判断疾病类型。

3. 实验室检测鉴别：通过血清学检测、分子生物学检测等实验室手段，可以检测出病原体的存在和类型，为疾病的鉴别提供科学依据。

三、治疗方法针对猪流感和猪感冒的治疗，应该根据病情严重程度和病原体的不同进行具体的治疗方案。

1. 病毒抑制治疗：猪流感和猪感冒都是由病毒引起的，因此抗病毒治疗是治疗的重要手段。

对于猪流感可以选择使用抗流感病毒药物进行治疗，对于猪感冒可以选择使用抗病毒药物和中草药进行治疗。

2. 对症治疗：针对猪流感和猪感冒的不同症状，可以采用相应的对症治疗方法，如退烧、止咳、清鼻涕、抗感染等措施。

3. 免疫治疗：对于猪流感和猪感冒，可以采用疫苗接种和免疫增强措施，提高猪的抵抗力，减少疾病的发生和传播。

四、预防控制为了有效预防和控制猪流感和猪感冒的发生和传播，应该采取以下预防控制措施。

1. 加强养殖环境管理：保持猪舍的清洁卫生，定期消毒和通风，减少病原体的传播。

3. 严格隔离管控：及时发现患病猪，并进行隔离治疗，防止疾病的传播。

4. 加强饲养管理：合理饲养和喂养，保证猪群的营养充足，提高猪的抵抗力。

猪流感的诊断学研究进展

ＥＩＡ试验程序：化病毒抗原包ＬＳ纯中图分类号：８８８文献标识码：文章编号：０８０１（０６１（）０４ — ２￥５．２Ｂ１０ — ４４２０）０上一０４０
被— — 加入１０稀释的待检血清（０：４３
猪流感的诊断学究进展
王伟禄顾永远孙泉云
２１０；０１９（．海市闽行区农业综合执法大队，海１上上２上海市闵行区疾病预防控制中心；．．３上海市畜牧兽医站）
ＨＮ抗体的商品ＥＩＡ试剂，主要用ＬＳ
维普资讯
ＬｖＳｏｃＤＰ｜ＥＴＫＡＮｏＵＴＬＲＹ｜ＮＤＵＲＹＮ２７ＳＴｏ．ｏ
南方荠猪创额论坛论文
出检测猪流感Ｈ．．体的商品ＥＩＡＮ抗ＬＳ
试剂，０５年又开发出检测猪流感２０
酸生物化学为基础的分子生物学诊断
的双份血清样品，如恢复期抗体效价较急性期增高４倍或以上，即有诊断价值。经ＨＩ验检测。在感染后７试猪～１０ｄ即能检出抗体，并能确定是否为早期抗体（Ｍ）成熟抗体（ｇ。针Ｉ或ｇＩＧ）
ｍｎ — — 加入酶标抗体（０ｍｎ — — ｉ）３ｉ）加入底物（５ｍｉ） — 加入终止液并１ｎ — 测定Ｏ６０ｎ值。本方法操作方便Ｄ５ｍ快速，据可靠，景值低。于大规数背适

H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

作者简介：大飞（９１．，东莱阳人，士研究生．从事流感病毒分子生物学及分子疫苗的研究。＊通讯作者刘１８一）男山硕主要
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ＣｏｔｕｔｏｆａＢｉｉｔｏｃＥｘｅｓｏｃｏｎａｎｉｈｒｔｕｔｒｌｎｓｒｃｉｎＯｃｓｒｎｉｐｒｓｉｎＶｅｔｒＣｏｔｉｎｇｔｅ５ＮｏｓｒｃｕａＲｅｉｎＧｅｅａｄＳｔｕｔｒｌＰｒｔｉ１ＧｅｅＯｇｏｎｎｒｃｕａｏｅｎＰｎｆＦＭＤＶｆＡｓａ１Ｏｉ
有较高的同源性（为９．）交叉血凝抑制试验显示，３株与其他３毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流均９４。Ｓ
感病毒传播与复制间的特殊地位，密切监测猪流感。应关键词：猪流感病毒；ＨＡ基因；隆；原性分析克抗
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维普资讯
动物医学进展。０８２（）５９２０，９３：—
ＰｒｇｒｓｎＶｅｅｉａｙＭｅｃｎｏｅｓｉｔｒｎｒｄｉｉｅ
Ｈ３Ｎ２亚型猪流感病毒ＨＡ基因序列测定及抗原性分析

猪流感的诊断技术研究进展

蛋白具有识别并吸附红细胞表面受体的结构，同时，ＨＡ蛋白的抗体与该蛋白受体的特异性结合能够干扰ＨＡ蛋白与红细胞受体的结合，基于这一原理，ＤｕｅａＭ等¨ｏ在１９４２年建立了血凝试验（ＨＡ）和血凝抑制试验（ＨＩ）。由于血凝试验方便、快捷、易于操作，常用于检测培养物中的流感病毒。
１．３．２
免疫荧光法（ＩＦＡ）
万方数据
７６
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖａｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２０１０年第６期
昂贵，而且需要熟练的技术操作人员，故Ｉ临床检测价值较低。
１．２
Ｄｅｕｓｏｎ等对常量ＮＩ试验方法进行了改造，建立
了微量ＮＩ试验方法，既降低了抗原用量，又可对多种分离物同时进行抗原分类，为此，一直被世界卫生组织推荐用于ＮＡ亚型的分类。美国国立兽医实验所已将微量Ｎｌ试验方法列为流感病毒分离物定型及筛选畜禽血清亚型ＮＡ抗体的常规方法∞。。
１
１．１
ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）属引起的
一种猪的急性、高度接触性呼吸道传染病，以突发、咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征；各种年龄、性别和品种猪均能感染，发病率高，恢复缓慢，阻碍增重，降低料肉比，直接影响猪群健康状态和质量，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病之一。对养猪业危害极大。自１９１８年首次报道猪流感以来，迄今为止，欧、美、非、亚、澳等世界各大洲均有猪流感的发生和流行。迄今已发现的Ａ型ＳＩＶ有Ｈ１
Ａｃａｄｅｍｙ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＥｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＬａａｚｈｏｕＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ
２Ｃｏｌｌｅｇｅ
ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ

利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体

ｗｅｔｒｌｔＢＡＬｃｍｉｅｗｅｅｉｏｕａｅｔ０ｇｏｅｒｃｍｂｎｎｌｓｄａｄｓｌｅｅｌｕｅｏｓｏ．ｔｉｏｓｎｂｏ．ｅＢ／ｃｒｎｃｌｔｄｗｉ１ｆｅｏｉａｔａｍｉｎｐｅｎｃｌｓｄｆｒｆｉｎＨｙ＇ｄｍａｈ０ｈｔｐｓｕｒ
光ＯＡ＠ｗｓｒｌ检测表明ＮＦ）ｅｅｂｏｔｎｔＰ蛋白在２３细胞中获得了表达。将ｐＡＧ－Ｐ以ｉ０９ＴＣＧＳＮ０
龄４５周龄ＢＬ／鼠，３次免疫后，利用杂交瘤细胞融合技术获得１株稳定分泌抗ＳＶＡＢｃ小ＩＮＰ的ＭＡｂ杂交瘤细
感的诊断方法以及分析ＮＰ蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。
关键词：猪流感病毒；核蛋白基因；真核表达；单克隆抗体
中图分类号：￥５．５８２６文献标识码：Ａ文章编号：１０ —５９２１）６０６ —４０８０８（０００．４００
ＡｂｒｔＴｏｏｔｕｔｈｅｒｃｓｔａｃ：ｃｎｓｒｃｔｅｏｍｂｉｎｔｐｌｓｉｎａａｍｄｐＣＡＧＧＳ。ＮＰ．ＮＰｅｏｆｓｎｌｆｕｅｚａｖｉｕｓａｓｃｏｄｎｏｇｎｅｗｉｅｎｌｎｒｗｓｕｂ—ｌｎｅ１ｔａｅｋａｏｉｘｐｅｓｏｖｔｒｐＣＡＧＧＳｎｔａｆｃｅｉｔｕｒｔｃｅｒｓｉｎｅｃｏｙａｄｒｎｓｅｔｄｎｏ２９３Ｔｃｌ．ＥｘｅｓｏｏｆＮＰｏｅｉｗａｃｎｆｒｅｂＩｅｌｓｐｒｓｉｎｐｒｔｎｓｏｉｍｄｙＦＡｎｄａ

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

中国畜牧兽医 2024,51(4):1642-1650C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析韩慧1,郭亚晶1,颜广智2,陈盛楠2,刘明杰2,莫美连2,黄良宗1(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院,佛山528000;2.广东方道基因生物科技有限公司,佛山528000)摘要:ʌ目的ɔ了解广东地区猪流感病毒(S w i n e i n f l u e n z a v i r u s ,S I V )的流行情况并探究其分子生物学特征㊂ʌ方法ɔ采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定㊁遗传进化和关键氨基酸位点分析㊂ʌ结果ɔ样品经实时荧光定量R T -P C R 检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1ʒ128;8个基因片段序列结果经B L A S T 比对和进化树分析显示,HA ㊁N A 基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H 1N 1)分支,P A ㊁P B 1㊁P B 2㊁N P 和M 基因属p d m /09分支,N S 基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)㊂关键氨基酸位点分析显示,分离株HA 蛋白裂解位点序列为P S I Q S R /G L ,具有典型低致病性流感病毒的分子特征㊂HA 基因在受体结合位点处的190㊁225㊁226位氨基酸分别为D ㊁E ㊁Q ,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能㊂N A 基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M 基因3处氨基酸位点突变为V 27A ㊁A 30T ㊁D 44A ,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加㊂ʌ结论ɔ本研究分离鉴定的毒株为G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征㊂本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据㊂关键词:欧亚类禽猪流感病毒;分离鉴定;序列分析;H 1N 1亚型中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.032 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-11-17基金项目:广东省自然科学基金项目(2017A 030310612)联系方式:韩慧,E -m a i l :1570387219@q q .c o m ㊂通信作者黄良宗,E -m a i l :l i a n g z o n g h u a n g@f o s u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dG e n e t i cE v o l u t i o nA n a l ys i s o f a E u r a s i a nA v i a n -l i k e S w i n e I n f l u e n z aV i r u sH A N H u i 1,G U O Y a j i n g 1,Y A N G u a n g z h i 2,C H E NS h e n gn a n 2,L I U M i n g j i e 2,MO M e i l i a n 2,HU A N GL i a n g z o n g1(1.S c h o o l o f L i f eS c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g ,F o s h a nU n i v e r s i t y ,Fo s h a n 528000,C h i n a ;2.G u a n g d o n g F i n d e r g e n eB i o t e c h n o l o g y C o .,L t d .,F o s h a n 528000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e e x pe r i m e n tw a s a i m e d t ou n d e r s t a n d t h e p r e v a l e n c e of S w i n e i n f l u e n z a v i r u s (S I V )i n G u a ng d o n g a n de x p l o r e i t sm o l e c u l a rb i o l o g i c a l ch a r a c t e ri s t i c s .ʌM e t h o d ɔN a s a l s w a ba n dl u n g t i s s u es a m p l e so f p i g ss u s pe c t e dt ob e i nf e c t e d w i t hS w i n e i n f l u e n z av i r u sw e r e c o l l e c t e d f r o ma p ig f a r m i nG u a n g d o n g f o r v i r u s i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ,g e n e t i c e v o l u t i o n a n d k e y a m i n o a c i d s i t e a n a l y s i s .ʌR e s u l t ɔTh e s a m pl e sw e r e t e s t e d p o s i t i v e f o rS w i n e i n f l u e n z av i r u s n u c l e i c a c i db y R e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P C R.I n t h e r e db l o o dc e l l a g gl u t i n a t i o n t e s t ,t h ev i r u s e x h i b i t e d a g g l u t i n a t i o nw i t h c h i c k e n r e db l o o d c e l l s ,w i t hah e m a g gl u t i n a t i o n t i t e r o f 1ʒ128.T h e r e s u l t s o f s e q u e n c i n g a n a l y s i so f e i g h t g e n es e g m e n t sw e r ea n a l y z e db y B L A S Tc o m pa r i s o na n d4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析c o n s t r u c t i o no fe v o l u t i o n a r y t r e e s,a nd HA a n d N A ge n e sb e l o n g e dt ot h eE u r a s i a na v i a n-l i k e S w i n e i nf l u e n z av i r u s(H1N1)b r a n c h,P A,P B1,P B2,N P a n d Mg e n e sb e l o n g e d t o th e p d m/09 b r a n c h,a n d N S g e n eb e l o n g e dt ot h e N o r t h A m e ri c a nt r i p l er e a s s o r t a n tb r a n c h,t h e r e f o r e,t h e i s o l a t e i n t h i s s t u d y b e l o n g e dt o t h eG4g e n o t y p eE u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n e i n f l u e n z av i r u s,a n d w a s n a m e dA/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1).K e y a m i n oa c i ds i t e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e c l e a v a g e s i t e s e q u e n c e o fH A p r o t e i no f t h e i s o l a t ew a sP S I Q S R/G L,w h i c hh a d t h em o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f a t y p i c a l l o w p a t h o g e n i c i t y i n f l u e n z a v i r u s.T h e a m i n o a c i d s a t p o s i t i o n190,225 a n d226o f t h e r e c e p t o rb i n d i n g s i t eo f HA g e n ew e r eD,Ea n dQ,r e s p e c t i v e l y,w h i c hs u g g e s t e d t h a t i t h a dt h e p o t e n t i a l a b i l i t y t ob i n dt ot h eh u m a ns a l i v a r y a c i dr e c e p t o ra n d i ta l s oh a dt h e p o t e n t i a l t ob i n da v i a ns i a l i ca c i dr e c e p t o r s.N o n eo f t h ea m i n oa c i dr e s i d u e so f N A g e n ew e r e m u t a t e d,s u g g e s t i n g t h a t t h e i s o l a t ew a s s e n s i t i v e t on e u r a m i n i d a s e i n h i b i t o r s s u c ha s o s e l t a m i v i r a n d z a n a m i v i r.H o w e v e r,t h em u t a t i o n s a t t h r e e a m i n o a c i d s i t e s i n M g e n ew e r eV27A,A30Ta n d D44A,s u g g e s t i n g a ni n c r e a s e dr e s i s t a n c et oa m a n t a d i n e-b a s e dd r u g s.ʌC o n c l u s i o nɔT h es t r a i n i s o l a t e da n di d e n t i f i e di nt h i ss t u d y w a sa G4E u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n ei n f l u e n z av i r u s.T h e a n a l y s i s o f k e y a m i n oa c i ds i t e ss u g g e s t e dt h a t t h i ss t r a i nh a dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f a d a p t i n g t o r e p l i c a t i o na n d e n h a n c i n g v i r u l e n c e i nm a m m a l s.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d yp r o v i d e d r e f e r e n c e d a t a f o r t h e p r e v e n t i o na n d c o n t r o l o f s w i n e i n f l u e n z a i nG u a n g d o n g.K e y w o r d s:E u r a s i a n a v i a n-l i k e S w i n ei n f l u e n z a v i r u s;i s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n;s e q u e n c e a n a l y s i s;H1N1s u b t y p e猪流感是由猪流感病毒(S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,S I V)引起的猪的一种急性呼吸道传染病,临床症状以咳嗽㊁流鼻涕㊁发热㊁食欲减退为主[1]㊂猪的呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6两种唾液酸(s i a l i c a c i d,S A)受体,能感染人流感病毒和禽流感病毒,不同流感病毒同时感染猪时极易发生基因重排而产生新的流行毒株,所以猪被认为是流感病毒发生基因重排的混合器 [2-3]㊂流感病毒的重排是产生具有新抗原性和生物学特性的子代病毒的主要机制,可导致流感灾难性的大流行㊂不同亚型S I V在世界范围内猪群中呈地区性流行,其中以H1N1亚型S I V最为常见㊂H1N1亚型S I V又可分为经典H1N1亚型(C l a s s i c a l s w i n e i n f l u e n z a v i r u s,C S H1N1S I V)和欧亚类禽H1N1亚型(E u r a s i a na v i a n-l i k e H1N1S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,E A H1N1S I V)等㊂E A H1N1亚型S I V于1979年在欧洲猪群中首次被报道,之后欧洲H1N1亚型S I V主体变成了E A H1N1亚型S I V[4]㊂中国E A H1N1分支于2001年首先报道于香港,随后在各地猪群中传播开来,分离率不断上升,目前已成为中国猪群中流行的优势毒株[5]㊂2009年,墨西哥暴发了席卷全球人群的甲型H1N1(P a n d e m i cH1N1 i n2009,p d m/09H1N1)流感病毒,成为21世纪第1次流感大流行,在全球范围内造成18000多人死亡[6]㊂大流行之后p d m/09H1N1毒株在人群中持续传播并传入猪群,p d m/09H1N1毒株在猪群中与E A H1N1亚型S I V等多种流行病毒发生基因重排,极大地危害了人类的公共健康[7]㊂2018年,猪群中E A H1N1亚型S I V与p d m/09H1N1亚型S I V等重排形成了多种基因型,其中G4基因型的重排方式是:HA和N A基因来自于E A H1N1亚型S I V,N S基因来自北美三源重排S I V,其余内部基因来自p d m/09H1N1亚型S I V[8-10],因此,这种G4基因型病毒对公共卫生构成更严重的威胁㊂目前,E A H1N1亚型S I V在中国南方的猪群中广泛传播,给人类健康带来严重威胁[11-12],因此,监测该地区S I V的流行和变异情况具有重要意义㊂2022年12月,在广东某猪场采集一批猪鼻拭子和肺脏组织样品,进行病毒分离鉴定,并对分离病毒进行全基因组基因测序和遗传进化分析,以了解分离病毒的起源及遗传进化特征,为广东省猪流感综合防控提供参考依据㊂1材料与方法1.1病料、S P F鸡胚病料为采集于广东省某猪场的猪肺脏组织和鼻拭子;9~10日龄S P F鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司㊂3461中国畜牧兽医51卷1.2主要试剂2ˑP h a n t aM a x M a s t e rM i x(D y eP l u s)㊁R N A 提取试剂盒(R N AI s o l a t e rT o t a lR N A E x t r a c t i o n R e a g e n t)㊁反转录试剂盒(H i S c r i p tⅡ1s tS t r a n d c D N AS y n t h e s i sK i t)㊁胶回收试剂盒(F a s t P u r eG e l D N A E x t r a c t i o n M i n iK i t)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;D L2000D N A M a r k e r购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.3病毒分离、鉴定及纯化将肺脏组织研磨液和鼻拭子液8000r/m i n离心5m i n,取上清过0.22μm滤膜除菌,接种于9~ 10日龄S P F鸡胚尿囊腔中,于37ħ恒温培养箱培养,去除24h内死亡鸡胚,72h后收集鸡胚尿囊液㊂按照上述方法将尿囊液再次接种鸡胚盲传2代,收集第3代尿囊液,通过S I V实时荧光定量R T-P C R 检测方法[13]和鸡红细胞凝集试验鉴定获得的病毒液,于-80ħ保存备用㊂鸡红细胞凝集试验是在V 形孔微量血凝板上将1%鸡红细胞与不同倍比稀释度的病毒反应,将血凝板倾斜70ʎ,观察沉淀于孔底的红细胞是否向下呈线状流动,以出现全部凝集(红细胞无流动)的最大稀释度为本分离株的血凝效价㊂1.4病毒全基因组扩增按照R N A提取试剂盒说明书提取病毒R N A,使用反转录通用引物(U n i12:5'-A G C A A A A G C A-G G-3')按照反转录试剂盒使用说明书进行反转录,合成c D N A㊂P C R引物参照H o f f m a n n等[14]建立的流感病毒全基因扩增方法合成,引物信息见表1㊂引物均由金唯智生物科技有限公司合成㊂根据高保真酶2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e P l u s)说明书分别扩增分离株的8个基因(P B1㊁P B2㊁P A㊁H A㊁N A㊁N P㊁M和N S基因)节段㊂P C R反应体系50μL:2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e p l u s)25μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各2μL,c D N A模板3μL,d d H2O补至50μL㊂P C R反应条件:95ħ预变性3m i n;95ħ变性15s,58ħ退火15s,72ħ延伸2m i n,共35个循环;72ħ延伸5m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定㊂扩增产物用胶回收试剂盒回收并送金唯智生物科技有限公司进行测序㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物大小P r o d u c t s i z e/b pP B2F:T A T T G G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T C G T T T2341 P B1F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G C A T T T2341 P A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A C T T2233 H A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T1778 N A F:T A T T G G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G A G T R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G A G T T T T T T1565 N P F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T A T T T T T1413 M F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G T A G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A G T T T T T1027 N S F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T8901.5病毒遗传进化分析测序结果通过S e q M a n软件拼接,N C B I网站在线B L A S T进行序列比对㊁相似性分析,通过N e t N G l y c1.0软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分析预测潜在糖基化位点,在G e n B a n k中下载参考序列,使用M e g a7.0基于N e i g h b o r-J o i n i n g方法构建遗传进化树,B o o t s t r a p值为1000㊂2结果2.1病毒分离鉴定经S I V实时荧光定量R T-P C R检测,鸡胚尿囊液样品C t值为20.88,判定为S I V核酸阳性(图1)㊂将收获的鸡胚尿囊液进行红细胞凝集试验,结果显示,有血凝性,血凝效价为1ʒ128㊂将分离得到的毒株命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022㊂2.2分离株全基因组测序通过R T-P C R对病毒的8个基因片段进行扩增,得到P B1㊁P B2㊁P A㊁HA㊁N A㊁N P㊁M和N S8个基因片段,大小分别为2341㊁2341㊁2233㊁1778㊁1565㊁1413㊁1027和890b p(图2),与预期目的条带大小相符㊂44614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析1,鸡胚尿囊液;2,阴性对照1,C h i c k e ne m b r y o a l l a n t o i c f l u i d ;2,N e g a t i v e c o n t r o l 图1 实时荧光定量R T -P C R 检测结果F i g.1 R e s u l t s o fR e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P CR M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1~8,P B 1㊁P B 2㊁P A ㊁HA ㊁N A ㊁N P ㊁M 和N S 基因M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1-8,P B 1,P B 2,P A ,HA ,N A ,N P ,M a n d N S g e n e s ,r e s p e c t i v e l y图2 分离株各基因片段P C R 扩增结果电泳图F i g .2 E l e c t r o p h o r e s i so fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so fe a c h g e n e f r a gm e n t o f t h e i s o l a t e 2.3 遗传进化分析2.3.1 病毒全基因组相似性分析分离株A/s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022的8个基因片段与G e n B a n k 登录的基因序列比对结果显示,HA ㊁N A ㊁P B 2㊁N P 和M 基因均与2018年在北京出现的A/s w i n e /B e i j i n g/0301/2018(H 1N 1)相似性最高,核苷酸相似性分别为97.94%㊁97.60%㊁97.27%㊁98.31%和98.83%,因此,进一步判定分离毒株属于H 1N 1亚型毒株,并将其命名为A /s w i n e/G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1);P A 基因与A /s w i n e /S h a n d o n g /L Y 142/2017(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为97.65%;N S 基因与A /s w i n e /L i a o n i n g /C Y 1833/2020(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为98.86%;P B 1基因与A /s w i n e /A n h u i /H D 21/2020(H 1N 1))核苷酸相似性最高,为96.92%㊂2.3.2 H A 氨基酸序列分析分离毒株A/s w i n e /G u a n g d o n g /C J M 2/2022(H 1N 1)HA 基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R /G L ,与近年来E AH 1N 1亚型S I V H A 裂解位点氨基酸组成相同,裂解位点仅含有1个碱性氨基酸(R ),具有低致病性流感病毒的特征㊂利用N e t N G l y c 1.0软件预测H A 蛋白潜在糖基化位点,结果显示,H A 蛋白具有5个潜在的糖基化位点,分别为26N S T D ㊁38N V T V ㊁288N C T T ㊁493N G T Y 和552N G S L ㊂2.3.3 N A 氨基酸序列分析分离毒株A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)N A 基因含有7个潜在糖基化位点,分别为44N Q S E ㊁58N N T W ㊁63N Q T Y ㊁68N V S N ㊁88N S S L ㊁146N G T V 和235N G S C,在58位多出1个潜在糖基化位点N N TW ㊂N A 蛋白氨基酸序列对神经氨酸酶抑制剂类药物如扎那米韦和奥司他韦的敏感位点119(E )㊁152(R )㊁275(H )㊁293(R )㊁295(N )的氨基酸残基均未发生突变㊂2.3.4 病毒表面基因遗传进化分析在N C B I 下载相关序列,通过M e g a 7.0分析软件,将分离株的HA 基因与G e n B a n k 中的C S H 1N 1㊁E AH 1N 1㊁类人型H 1N 1和p d m /09分支代表毒株进行比对分析并构建遗传进化树㊂结果显示,分离株的HA 基因位于E A H 1N 1进化分支(图3);由N A 基因进化树可看出,分离株的N A 基因也位于E A H 1N 1进化分支(图4)㊂5461中国畜牧兽医51卷图3 H A 基因进化树F i g .3 P h y l o ge n e t i c t r e e of H Ag e ne 图4 N A 基因进化树F i g .4 P h y l o ge n e t i c t r e e of N Ag e n e 64614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析2.3.5内部片段基因序列位点分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)序列进行关键氨基酸位点比对分析㊂P B2蛋白氨基酸位点进行比对发现,T271A㊁A590S和A591R的组合发生了突变㊂P B2蛋白中第431位氨基酸发生了T431M突变,第588位氨基酸发生了T588I突变㊂P B1蛋白的氨基酸位点H436Y发生替换㊂P A蛋白的P224S㊁L295P㊁A515T位点发生替换㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点发生替换㊂M蛋白的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生替换㊂N S蛋白关键氨基酸位点没有发生突变㊂2.3.6内部片段基因遗传进化分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)进行遗传进化分析,绘制进化树㊂分离株的P B2㊁P B1㊁P A㊁N P和M基因遗传进化分析结果显示,均来位于p d m/09H1N1分支㊂而N S基因处于北美三源重组分支(图5)㊂通过对分离毒株A/ s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1)的8个基因节段的序列分析发现,该毒株的HA和N A基因来源于E A H1N1分支,P B1㊁P B2㊁P A㊁N P和M基因来源于p d m09H1N1分支,N S基因来源于t r H1N2(N o r t hA m e r i c a n t r i p l e r e a s s o r t a n tH1N2)分支,这属于近几年流行的G4基因型E A H I N1 S I V㊂3讨论S I V可引起猪的高度传染性呼吸系统疾病,发病率高,传播速度快,使患病猪生产性能下降㊂此外,其对人类也有一定的感染性[15]㊂S I V的一个显著特性是通过不断的变异和进化来逃避宿主的免疫保护,从而引发新的流感暴发和流行㊂S I V的持续进化不仅改变了其毒力,还引发了更广泛的猪流感流行,严重威胁了公共卫生安全[16-17]㊂流感病毒H A蛋白受体结合区的特殊氨基酸位点是决定其宿主范围的关键因素,H1亚型流感病毒唾液酸受体结合能力一般取决于第190和225位氨基酸,分离株A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)中HA基因第190和225位氨基酸分别为D㊁E,第226位氨基酸为Q,表明其既具备结合S Aα-2,6-G a l型人流感病毒S A受体的特点,也有结合S Aα-2,3-G a l型禽流感病毒S A受体的可能[18]㊂A型流感病毒P B2蛋白上的627和701位点是影响病毒致病性的关键位点,如发生E627K或D701N突变会显著提高病毒毒力[19],本试验分离毒株未发现这两个位点的突变㊂本试验中,S I V P B2蛋白的T271A㊁A590S和A591R的组合发生突变,有研究表明,这有利于S I V在哺乳动物宿主中的复制效率和毒力[20]㊂P B2蛋白中单个氨基酸T431M 发生突变,该氨基酸的突变对于E A H1N1亚型S I V在小鼠体内的毒力中起着关键作用,会显著增强E A H1N1亚型S I V在小鼠中的毒力[21]㊂分离株的P B1蛋白氨基酸位点H436Y和P A蛋白P224S位点发生相同的突变,这2个位点的突变有助于增强病毒在小鼠身上的毒力[22]㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点突变,同样表明增强了对小鼠的致病性[23]㊂M基因的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生突变,提示分离株可能对金刚烷胺类药物耐药性增加[24]㊂G4基因型S I V自2016年以来在中国逐渐形成流行趋势,主要在猪群中传播[25]㊂该基因型毒株是来源于3种谱系的重排方式,包括E A H1N1㊁p d m/09H1N1病毒,以及综合了禽类㊁人类和猪的流感病毒基因的北美三源重组t r H1N2病毒,中国南方地区生态㊁地理和气候环境独特,猪场㊁鸡场密集及人和畜禽的频繁接触,有利于S I V的变异和流行[26]㊂分离毒株基因片段HA㊁N A与来自E A H1N1亚型S I V相似性较高,部分基因片段与p d m/09H1N1相似性较高,与北京㊁安徽㊁辽宁等省份的片段高度同源,提示分离株可能是在人流感病毒感染猪及生猪跨区域流动过程中重排产生㊂随着S I V的变异和与其他亚型病毒的重组,其跨种间传播的能力和感染人的风险也逐步增强㊂因此,加强对华南地区S I V的监测对公共卫生具有重要意义㊂对于养猪业来说,要采取有效的预防和控制措施,如定期消毒㊁加强饲养管理㊁提高猪群的免疫力等,以减少猪流感的发生和传播㊂74618461中国畜牧兽医51卷A~F,分别为P B1㊁P B2㊁P A㊁N P㊁M和N S基因A-F,P B1,P B2,P A,N P,M a n d N S g e n e s,r e s p e c t i v e l y图5内部片段基因进化树F i g.5P h y l o g e n e t i c t r e e o f i n t e r n a l f r a g m e n t s4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析4结论本研究分离到1株G4型欧亚类禽猪流感病毒(H1N1),将其命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)㊂HA基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R/G L具有低致病性流感病毒的分子特征,但在不同基因片段的关键氨基酸位点上发生了突变,这可能增强毒力和对哺乳动物的致病性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]黄良宗,颜广智,邓汝森,等.猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析[J].中国畜牧兽医,2020,47(8):2625-2633.HU A N GLZ,Y A N GZ,D E N G RS,e t a l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o na n d g e n e t i ce v o l u t i o na n a l y s i so fS w i n ei n f l u e n z av i r u sf r o m G u a n g d o n g p r o v i n c e[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2020,47(8):2625-2633.(i nC h i n e s e)[2]I T O T,C O U C E I R O J N,K E l M S,e t 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猪繁殖与呼吸综合征研究进展

猪繁殖与呼吸综合征研究进展猪繁殖与呼吸综合征是一种由高致病力的冠状病毒引起的猪类疾病，主要特点是高度致病性、迅速传播、临床症状严重。

近年来，随着对猪繁殖与呼吸综合征的研究不断深入，人们对该疾病的病原学、发病机制、流行病学等方面有了更为深入的了解。

本文将综述猪繁殖与呼吸综合征研究的进展。

首先，猪繁殖与呼吸综合征的病原学研究取得了重要进展。

通过病毒分离、基因序列分析等方法，已将该疾病的病原鉴定为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。

分子流行病学研究发现，PRRSV至少存在两个主要亚群，即欧洲亚群和美洲亚群，且存在较高的遗传变异率。

近年来，病毒亚群之间的基因重组事件越来越频繁，使得疫苗的设计与开发面临更大的挑战。

其次，在病原传播途径方面的研究也取得了一定进展。

猪繁殖与呼吸综合征主要通过两种方式传播，即直接接触和通过空气传播。

病毒在病猪体内主要定殖在单核细胞系，但也可通过唾液、粪便和尿液等分泌物和排泄物进行传播。

此外，病毒在猪场内环境中的存活时间较长，使得传播风险更高。

因此，加强猪场内环境卫生管理对于控制疾病传播具有重要意义。

最后，针对猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制研究也在不断深入。

目前，该病的主要控制措施包括疫苗接种、生物安全措施和药物治疗等。

疫苗接种是目前预防猪繁殖与呼吸综合征的主要手段，但由于病毒变异率高，疫苗的保护效果存在一定局限性。

因此，研发针对该疾病不同亚群的疫苗仍然是当前的研究重点。

此外，加强生物安全措施，如限制人员流动、加强检疫和消毒工作，有效地控制了疾病的传播。

还有一些研究表明，采用抗病毒药物对病猪进行治疗也可以取得一定的效果，这对于控制疾病的严重程度具有一定的意义。

总之，随着对猪繁殖与呼吸综合征研究的不断深入，人们对该疾病的病原学、传播途径、预防和控制等方面有了更全面的认识。

然而，由于该疾病的病原特性和环境因素的影响，对其完全控制仍存在挑战。

因此，需要进一步加强对猪繁殖与呼吸综合征的研究，以期能够开发出更有效的防控措施，为猪产业的健康发展提供保障。

分子生物学论文范文(前沿资讯6篇)

分子生物学论文范文（前沿资讯6篇）分子生物学作为一门新生的学科，仍然处于成长的初级阶段。

学科背景迥异的科学家从各自的知识领域出发，对分子生物学领域的基本问题不断探索，由单一分析转向综合分析，去研究生物的多样性与生命本质的一致性。

下面是6篇分子生物学论文，希望你阅读后有收获。

分子生物学论文范文精选一：题目：牛病毒性腹泻病毒分子生物学特性研究进展摘要：牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）是引起牛黏膜病的病原，该病原给养牛业造成重大的损失，致病机理十分复杂。

与丙肝病毒同属黄病毒科，二者有很高的同源性，所以被用作HCV的模式病毒。

其基因组为一单股正链RNA分子，编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白，这些蛋白质在病毒的复制、翻译及与宿主细胞的相互作用中发挥重要作用。

随着对该病毒及同属的其他病毒研究的深入，人们对该病毒的致病机制、免疫逃避、遗传特性等方面有了一定的认识。

本文综述了该病毒及其同科病毒编码的蛋白质的主要功能，为该病的防治及其他病毒的深入研究提供参考依据。

关键词：牛腹泻病毒；致病机理；RNA病毒；免疫逃避；遗传牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是引起牛腹泻病及粘膜病的主要病原，临床症状复杂多样，可表现为亚临床感染，或出现繁殖障碍和由免疫抑制导致的呼吸系统、消化系统性疾病，以及由血小板减少、出血导致的致死性粘膜病。

由于BVDV致病机理复杂，并且缺乏有效的防控技术，因此BVDV在世界范围内广泛流行，是造成全球乳/牛业经济损失的重要病原。

此外，随着体外受精与胚胎移植在养牛业中的普及和应用，研究人员发现利用感染有BVDV的精液培育出来的胚胎若移植到受体母牛代孕后，受体母牛和新生犊牛均会成为BVDV携带者，这会进一步造成养牛产业的经济损失。

近年来，BVDV病毒疫情呈现再次爆发的势头，给畜牧业和人类健康带来了严重危害。

应用于兽用疫苗研发的病毒载体研究进展

ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ；ｖｅｔｅｒｉｎａｙｒｖａｃｃｉｎｅｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｌｉｖｅｖｅｃｔｏｒｖａｃｃｉｎｅｓ
ｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｓｍｏｓｔｏｆｔｈｅｖｉｒａｌ —ｖｅｃｔｏｒｂａｓｅｄａｎｔｉｇｅｎｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｅｌｏｐｅｄｆｏｒｖａｃｃｉｎｅ
随着分子生物学技术的发展和应用，疫苗的研
有实用性的载体。近２０年来，只有少数几种ＤＮＡ
病毒及ＲＮＡ病毒被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
１ＤＮＡ病毒载体
制和开发取得了快速的发展。以重组病毒作为基
ｔｅｓｔｉｎｇｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｙｒｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＤＮＡａｎｄＲＮＡｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｐｏｘｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，

猪流感病毒分子生物学研究

Ｍｏｅｕａｉｌｇｔｄｎｓｎｎｕｎａｖｒｓｌｃｌｒｂｏｏｙｓｕｙｏｗｉｅｉｆｅｚｉｕｌ
Ｙｕｈｕａ
（ｉｕｎＥｔ－ｘｓｅｔｎａｄＱａａｔｅｕｅｕｏＰＲＣｉａＳｃｕｎＣｅｇｕ６０４）ＳｃａｎｒＥｉＩｐｃｏｕｒｎｉｒａｆ．．ｈｎ，ｉａｈｎｄ，１０１ｈｙｔｎｉｎｎＢｈ
ａｔｃｅｍａｎｌｓｕｓｄｔｅｓｕｙａｏｌｃｌｒｂｉｌｇ，ｅｏｔｕｔｒｎｕｔｏｆｓｎｎｕｎｚｒｉｌｉｙｄｉｃｓｅｈｔｄｂｕｔｍｏｅｕａｏｏｙｇｎｍｅｓｒｃｕｅａｄｆｎｃｉｎｏｗｉｅｉｆｅａｌ
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广泛流行于猪群中的主要有古典型猪ＨＮ、禽型类
ＨＮ和类人型ＨＮ毒株ｌ５＿。猪流感病毒主要引起的是一种急性高度接触
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ＫｅｏｒｓＩｆｅｚｉｓＳｎ；ｌｃｌｒｉｌｇｙｗｄ：ｎｕｎａｖｒ；ｗｉｅＭｏｅｕａｏｏｌｕＢｙ
流感病毒根据Ｍ蛋白和ＮＰ蛋白的分型差异可分甲、、乙丙三个型，流感病毒属于Ａ型流感病猪毒，为正黏病毒科流感病毒属成员，基因组由分其节段单股负链的ＲＡ组成ｌ根据遗传特性和抗原Ｎ１ｌ。
入境检验检疫工作。Ｅｍａ：ｈｎｄｈａｕ１３ｃｎ。 — ｉｃｅｇｕｕｙ＠６．ｌｏ

猪流感病毒的演化

猪流感病毒的演化赵玉仲;韩乐斌;桑浩田;刘思当;肖一红;侯衍猛【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2024(41)3【摘要】猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是感染猪的一种。

呼吸道病毒,可对公共卫生产生重要影响。

以往研究通过全基因组测序以及分子生物学、流行病学等多方面的手段,全面揭示了SIV的演化进程。

为了更好地理解和应对SIV演化,对其演化历程进行了简要回顾,系统梳理了其分类、基本特征、演化及流行。

通过对SIV演化的深入分析,发现其基因变异频率较高,不断发生基因重配和突变,推动病毒不断演化。

此外,在猪群中发现了多种亚型SIV,而且不同地区的SIV演化存在显著差异,其中一些地区的SIV可能存在感染人的潜在风险。

总体而言,SIV演化是一个复杂而动态的过程,其演化趋势可能对人类和动物健康构成潜在威胁。

因此,加强对SIV演化的研究,提高对其监测和控制的能力,对于维护畜牧业健康发展和公共卫生安全具有极为重要的意义。

【总页数】9页(P80-88)【作者】赵玉仲;韩乐斌;桑浩田;刘思当;肖一红;侯衍猛【作者单位】山东农业大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.辽宁省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析2.人源H3N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2005的分离鉴定及全基因遗传演化分析3.H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究4.H1N1亚型猪流感病毒广东分离株全基因克隆及其遗传演化分析5.一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流感病毒

一株人源H1N1亚型猪流感病毒的进化分析与生物学特性研究唐续1，杨焕良1，鄢明华2，李秀丽2，陈艳1，孟沙沙1，尹航1，辛晓光1，步志高1，乔传玲1*，陈化兰1*(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物国家重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001；2.天津市畜牧兽医研究所，天津300112)摘要：为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况，我们2009年11月从河北某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子40份，接种10日龄SPF 鸡胚，分离到一株猪流感病毒，通过RT-PCR 和血凝抑制试验鉴定为H1N1亚型，命名为A/swine/Hebei/15/2009(H1N1)，其全基因序列测定及同源性分析发现，8个基因片段均与2000年左右H1N1人流感病毒有较高的同源性。

系统遗传演化显示，该病毒分离株是由2000年人源H1N1流感病毒A/Dunedin/2/2000(H1N1)进化而来。

抗原性分析显示该株与甲型H1N1流感病毒和经典H1N1病毒株抗原性差异较大。

对小鼠致病性试验表明该病毒株可以直接感染小鼠并导致小鼠轻微临床症状和组织病理学变化，但不致死小鼠，表现为低致病性。

关键词：猪流感病毒；人源H1N1亚型；遗传演化分析；抗原性分析；致病性中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2012)04-0270-04Evolution analysis and biological characteristics of a human originH1N1subtype swine influenza virusTANG Xu 1*,YANG Huan-liang 1*,YAN Ming-hua 2,LI Xiu-li 2,CHEN Yan 1,MENG Sha-sha 1,YI Hang 1,XIN Xiao-guang 1,BU Zhi-gao 1,QIAO Chuan-ling 1*,CHEN Hua-lan 1*(1.Animal Influenza Key Laboratory of the Ministry of Agricultural,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China;2.Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Tianjin 300112,China)Abstract :To isolate the swine influenza virus (SIV),a total of 40nasal swabs samples were collected from pigs which had influenza like symptoms in Hebei province in November,2009.A virus was isolated by inoculation of 10-day-old embryonated eggs via allantoic cavities and identified as H1N1subtype by hemagglutination inhibition (HI)test and RT-PCR,designated A/Swine/Hebei/15/2009(H1N1).The complete genes were sequenced and the results shown that the eight gene segments of the isolate were closely identical to human H1N1influenza virus A/Dunedin/2/2000(H1N1).The genetic analysis indicated that the virus was directly derived from the human H1N1influenza virus.HI tests found that the isolate had less cross reaction with the reference strains of pandemic H1N1or classical swine H1N1.In addition,the pathogenic tests in mice demonstrated the virus was 收稿日期：2012-02-06基金项目：国家973计划项目(2010CB534001)：哈尔滨市科技攻关计划(2009AA6BN078)；天津市科技支撑计划重大项目(10ZCZDNC02800)共同第一作者：唐续(1984-)，男，山西朔州人，硕士研究生，主要从事动物流感研究；杨焕良(1975-)，男，辽宁丹东人，助理研究员，博士研究生，主要从事动物流感研究.*通信作者：E-mail ：qcl@ ；hlchen1@中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第34卷第4期2012年4月Vol.34，No.4Apr.2012doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2012.04.05*Corresponding author;Equal contributors猪流感病毒(Swine influenza virus ，SIV)属正粘病毒科A 型流感病毒属，为单股负链分节段RNA 病毒，其基因组由8个独立节段构成，约为13.6kb 。

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动物医学进展,2010,31(S):2082212Progress in Veterinary Medicine猪流感病毒分子生物学研究进展余　华(四川出入境检验检疫局,四川成都610041) 摘　要:猪流感病毒主要引起一种急性高度接触传染性的群发性呼吸道疾病。

论文主要论述了猪流感病毒分子生物学特性、基因组结构及其功能等方面的研究进展。

关键词:流感病毒;猪;分子生物学中图分类号:S852.659.5文献标识码:A文章编号:100725038(2010)0420208205 流感病毒根据M蛋白和N P蛋白的分型差异可分A、B、C3个型,猪流感病毒属于A型流感病毒,为正黏病毒科流感病毒属成员,其基因组由分节段单股负链的RNA组成[1]。

根据遗传特性和抗原性的不同,A型流感病毒到目前为止已至少有16种亚型血凝素和至少9种亚型神经氨酸酶被发现[224],已发现的猪流感病毒至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2等7种不同血清亚型。

其中,广泛流行于猪群中的主要有古典型猪H1N1、类禽型H1N1和类人型H3N2毒株。

猪流感病毒主要引起的一种急性高度接触传染性的群发性呼吸道疾病,临床以突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征。

纯SI的病理变化主要表现为病毒性肺炎及其他呼吸器官的炎性变化,有其他病原继发或混合感染时,病理变化会严重而复杂[5]。

研究表明:猪的种间屏障相对较低,是禽、猪、人流感病毒唯一的共同易感宿主,是人流感病毒和禽流感病毒(A IV)双重感染的“混合器”或活载体。

一个细胞同时被两种流感病毒感染,导致基因重配的偶然发生。

从而产生抗原性改变的混合型流感病毒重组株,引起新的大流行。

1976年1月,美国新泽西州佛迪狄克斯5名新兵因感染猪源H1N1病毒而死于肺炎的事件[6],赋予SIV全新的公共卫生意义。

1　猪流感病毒分子生物学特性SIV基因组为分节段的,负链RNA,基因组在转录和复制过程中易于发生基因重排。

宿主细胞没有SIV复制所必需的依赖RNA的RNA复制酶和依赖RNA的RNA转录酶,因此这两种酶都是由自身基因编码的。

这两种酶在复制和转录过程中的忠实性不及DNA聚合酶和转录酶,这决定了病毒在复制和转录过程中有较高变异性。

事实上也是如此,SIV最显著的生物学特性就是变异频族,血清亚型众多。

A IV在两个方面进行变异—抗原漂移(drift)和抗原转变(shift)。

抗原漂移是基因组的点突变,特别是HA和NA的点突变造成HA和NA 较小范围的抗原性改变。

抗原转变则是由于基因组的大片段缺失和插入,造成抗原性较大的改变,以至于出现新亚型毒株和毒株毒力的变异[728]。

下面就猪流感病毒墓因组结构特征,编码蛋白的功能及其相互作用,流感病毒基因工程及其在猪流感病毒研究中的应用等做一概述。

2　猪流感病毒基因组结构及其功能A型流感病毒基因组为单股负链分节段的RNA,共有8个片段,片段126编码单基因产物,片段7、片段8分别编码两种蛋白,片段7编码基质蛋白Ml、M2;片段8编码非结构蛋白NS1,8个基因片段的3末端和5末端都有保守的核苷酸序列,末端13个核普酸序列是3′2GGAACAAA GAU GA PPP2 5′,3末端的核普酸序列是3′2O H2UC GU/CU UU2 C GUCC25′[7]。

在这些共有序列中有些可反向互补。

遗传学和生化试验证实在3′和5′末端保守序列是病毒转录的重要的核昔酸识别位置,这些序列的内部互补性对体内体外的最佳转录是至关重要的。

另外,这些末端序列也是激活流感病毒多聚酶的内切酶活性,切下宿主成熟mRNA帽子结构到病毒前体mRNA上所必需的。

转录体病毒基因表达也进一步阐明末端保守序列在病毒基因表达过程中起着重3收稿日期:2010203227作者简介:作者简介:余　华(1978-),男,四川人,硕士,主要从事动物及动物产品的出入境检验检疫工作。

要的功能。

2.1　血凝素血凝素(hemagglutinin,HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,为75ku的糖蛋白。

HA 在病毒吸附及穿膜的过程中起关键作用,可刺激机体产生中和抗体,HA在感染过程中可被水解为两条肽链HA1和HA2是感染细胞的先决条件[9210],另外HA的变异性很强,是病毒发生抗原变异的主要原因。

近年的研究证明HA也参与病毒宿主谱的识别,在决定病毒宿主范围方面扮演了一个重要角色。

有关禽流感病毒HA基因在抗原变异、决定病毒致病力和宿主范围方面的作用,陈化兰等和崔尚金等都做了详细的综述,在此不再赘述。

HA由片段4编码,是典型的Ⅰ型蛋自[11]。

它含有4个结构区域:信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。

用免疫学和生物学方法研究证明,HA在细胞内质网合成,合成后由内质网运送到高尔基体,最后到达细胞膜,嵌入胞膜的脂质双层,在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上[12]。

HA在运送过程中经过不断的修饰,如将N葡萄糖昔寡糖加到天门冬酞胺残基上。

有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。

修饰的位置随毒株不同而有区别,这样形成的单体HA分布在内质网上,在向高尔基体运送过程中,由二硫键连接并折叠形成一定的形状,随后形成三聚体,由高尔基体运送到细胞膜[13]。

HA产生后到其发挥作用时,还经过几个切割加工过程,包括N端信号肤的切除及HA1的产生。

N端的信号肽大约有16个氨基酸残基组成,其作用是识别内质网,HA合成后信号肽酶将这一短肽切除,成熟的HA不含信号肽。

另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链,产生HA1和HA2切割时去掉一个或多个氨基酸残基,这与宿主细胞及毒株的毒力有关。

HA I和HA2的分子质量分别为36ku和27ku,两条肤链被一个二硫键连在一起,再加上分子内的一些二硫键及其他非共价键的相互作用,使HA形成一定的立体结构。

通过X线晶体衍射技术,对HA的三级结构己经搞清。

2.2　神经氨酸酶神经氨酸酶(neuraminidase,NA)也构成病毒囊膜的纤突,其数量没有HA多,并且呈簇存在。

NA 是一种糖苷外切酶,可以从a2糖苷键上除去唾液酸(N2已酞神经氨酸),因此NA能从病毒和感染的细胞上除去唾液酸残基。

这一功能对病毒粒子以及防止病毒粒子聚集是很重要的[14]。

通过对温度敏感突变株NA的研究发现,NA不直接参与病毒的装配和出芽[15]。

NA还与病毒的宿主特异性及病毒的毒力有关,用去污剂、脂溶剂或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、链酶蛋白酶)处理可使NA纤突从病毒粒子上释放下来。

通过电子显微镜观察,可发现释放的NA纤突呈蘑菇状。

除掉去污剂后,这些纤突可通过疏水的茎部聚集在一起玫瑰获样。

链酶蛋白酶处理释放的纤突,具有完整的酶活性和抗原性,但不聚集呈玫瑰花形,分子质量也比用去污剂处理的释放的小。

这些结果表明,蛋白水解酶处理可切去疏水区使其不能聚集[16]。

病毒囊膜上的NA纤突使NA单体形成四聚体,它包括一个盒子状的头部和一个细茎,目前对其头部的三维结构己经搞清。

NA是一种糖蛋白,其蛋白部分由片段6编码。

目前对绝大多数亚型毒株的片段6序列已经清楚,并能从基因序列推测出其氨基酸序列。

通过对去污剂处理后释放的NA进行部分氨基酸序列分析,发现与根据基因推测的序列很一致。

NA蛋白质序列的特点是翻译后不经过切割;信号肤不被除去:翻译起始用的Met仍然存在;梭基端也不曾经过加工。

从基因序列推测出的氮基端序列位2甲硫氨酸2羟脯氨酸2异亮氨酸。

通过对NA进行测序,证明这一序列仍然存在。

2.3　核蛋白核蛋白(nucleop rotein,N P)是一种单体磷酸化的多肤,分子质量60ku,它是病毒核衣壳的主要蛋白成分[17]。

核蛋白具有型特异性,根据其抗原性的不同,可将流感病毒分为A,B,C型[18219]。

A型流感病毒的核蛋白由片段5编码,有2种形式,一种是可以移入核内的磷酸化形式(N P256),另一种是一直留在细胞质内的非磷酸化(N P253)的形式[20]。

A/ PR/8/34的N P由498个氨基酸残荃组成,富含精氨酸(Arg)。

A型流感病毒的N P序列与B型的有38%的同源性,与C型的有22%的同源性。

核蛋白是一种多功能的蛋白质,除了形成病毒的核衣壳外,可使vRNA形成RN P复合体以此来稳定vRNA,使其免受RN Ase作用,另外在病毒基因组的转录和复制也起作用,在确定病毒的宿主特异方面也有作用[21]。

核蛋白的磷酸化取决于宿主,与流感病毒的宿主谱有关。

N P是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原,至少具有3个独立的抗原位点。

通过用单克隆抗体和多克隆抗体进行研究,发现在所有被测毒株都有一个共同位点,针对这一位点的单抗能抑制病毒RNA分子体外转录。

针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供保护,用提纯的核蛋白免疫动物,也可能产生很微弱的抗感染能力[22]。

902余　华:猪流感病毒分子生物学研究进展2.4　基质蛋白流感病毒的基质蛋白(mat rix proteins)由病毒基因组片段7编码[23]。

片段7有两个读码框,可转录出两个mRNA,分别翻译出一种蛋白质。

因此流感病毒的基质蛋白有两种,即M1和M2。

M1由252个氨基酸残基组成,分子质量约26ku,它是病毒的主要结构蛋白,占流感病毒蛋白总量的40%[24]。

这种蛋白也具有型特异性,其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一[25]。

Ml位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧,维持病毒形态的结构蛋白。

另外Ml还可在感染细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上发现[26]。

研究表明M1的氨基端含有一亲水区,狡基端与病毒的转录酶之间有相互作用[27]。

流感病毒的M1具有多种功能,除维持病毒粒子的形态外,还调节病毒转录酶的活性,另外在子代病毒粒子装配方面也起重要作用。

据报道,M1单克隆抗体不能给动物提供被动保护。

M1不被糖基化,作为病毒的负调控基因,还与转录酶有关[28]。

M2由97个氨基酸残基组成,分子质量大约为15 ku,由片段7转录的第一个小mRNA翻译。

M2也是一种跨膜粒子通道蛋白,主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上,另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。

每个病毒粒子大约含有14268个M2分子[29]。

流感病毒M2的主要作用是,在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的P H值;在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境;另外在病毒装配过程中也起作用[30]。

研究表明,针对M2氨基端的单克隆抗体可抑制病毒蚀斑的增大,其作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同[31]。

用这种单抗筛选突变株时,不仅引起M2的突变,还能引起M I的突变。

流感病毒M2的氨基酸序列很保守,在所检测的毒株中,其同源性高达90%[32]。

这种蛋白在感染细胞的细胞膜上与I类糖蛋白相似,即氨基端在细胞外,狡基端在细胞内。