聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE
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凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关
二、电泳的原理
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ native－PAGE）
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生物大分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构 型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率就不 同，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和 酶等生物大分子的生物活性。
三、电泳操作流程 (SDS-PAGE)
1.制备PAGE胶
固定玻璃板 灌注分离胶，水封, 静置待凝固 吸干水，灌注浓缩胶，插入梳子, 静置待凝固
注意： a.催化剂TEMED要在注胶前加入,否则胶凝结而无法灌注. b.空气中的氧气的存在影响凝胶的聚合，因此，水封的 目的是隔绝空气中的氧气，并且使分离胶顶部平整。
相对迁移率 mR ＝
蛋白质样品区带中心迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心迁移距离(cm)
四、电泳的应用
常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于核苷酸多态性和蛋 白质的分析、分离。 SDS-PAGE则常用于测定蛋白质的分子量和蛋白质的 亚基数。目前已发现有些蛋白质不能用 SDS-PAGE测定分 子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的 蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
c.Acr和Bis具有神经毒，操作时应戴手套。Acr/Bis储液于棕色 瓶4℃保存。
2.加样
电泳槽内注入电极缓冲液， 使其完全淹没浓缩胶顶部， 小心拔出梳子
经SDS处理的样品， 于沸水中加热3 min， 以除去亚稳态聚合。
用微量移液器于距 槽底三分之一处进样
3.电泳
加样后的凝胶，应立即电泳。 样品进浓缩胶，电流控制在20－30 mA； 样品进分离胶，电流控制在40-50 mA。 待溴酚蓝条带泳动到距离胶板前沿约1-2cm处， 停止电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。
其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。
(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液 7％醋酸溶液。
3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤一、制胶前的准备1、玻璃板的准备用洗涤剂将玻璃板反复擦洗;然后用清水冲洗干净;待玻璃板晾干后;将1mm 塑料薄片沾少许清水;使其贴在玻璃板上;然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴..2、垂直平板支架的安装将准备好的玻璃板;放入垂直支架内;两侧用钢夹使其固定;钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜;两侧选用力度大小适中、对称的钢夹..3、玻璃板的密封将1%琼脂糖用微波炉加热融化后;倒入支架板底槽中;使其密封即可;然后用吸管吸取少量琼脂溶液;沿玻璃板两边的缝隙内加入;使其密封;待其冷却凝固后备用..二、凝胶的制备1、30%的丙烯酰胺溶液的配制1L配方：丙烯酰胺Acr290g 甲叉双丙烯酰胺Bis10g步骤：称取样品;倒入烧杯中用蒸馏水定容至1 L将烧杯置于搅拌器上;使溶液充分溶解至透明将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用2、10ｘTBE溶液的配制1L配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：7.44g步骤：称取各成分至烧杯用蒸馏水定容至1L用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解分瓶倒装待用3、PAGE凝胶的制备一块胶为例配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵AP200ul;TEMED溶液20ul步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶4、灌胶把垂直支架倾斜30°;将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜;倒入过程中要避免气泡的产生;发现有气泡产生时;要待气泡消失后再倒入..灌胶完成后;用枪吸取少量水密封胶口;压平胶面..当胶面与水之间有一条明显的界限时;表示凝胶已凝固;可以开始点样电泳..三、点样及电泳1、0.5ｘTBE缓冲溶液的配制量取950ml的蒸馏水;然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处;装瓶摇匀;备用..2、垂直平板电泳槽的安装将制作好的胶放入垂直电泳槽内;凹形玻璃向内侧..选择合适的梳子;轻轻插入玻璃板内;梳子底部与胶面刚好接触为宜..将插好梳子的玻璃板紧贴电泳槽的硅胶密封圈;用钢夹使其固定..倒入0.5ｘTBE缓冲溶液于电泳槽内;以刚好淹没凹形玻璃平口为宜..3、点样用微量移液器吸取1ul的溴酚蓝溶液;根据PCR产物量大小吸取适量样品;点入胶孔内即可..每次加样前;微量移液器要用蒸馏水清洗;以避免交叉污染..为了确保各个胶孔之间都相互隔离;在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端;看是否有渗漏现象;如果有渗漏现象;要重新安装梳子..每块胶都要点上maker标记..4、电泳点样结束后;接通电源;调节电压至300V;90min;时间电泳时间根据PCR产物分子量适当延长..四、染色、显影1、染色液、显色液的配制染色液：0.1%AgNO3..AgNO31g 加水至1L 溶解待用..显色液：2%NaOH..NaOH 20g 加水至1L溶解待用2、取胶把电泳完成后的玻璃板取下;小心拔出梳子揭去凹形玻璃;去掉底部的琼脂凝胶;小心将胶揭下;放入染色槽中3、染色将胶用蒸馏水冲洗2次;倒入适量的染色液;以淹没胶体为宜;计时10min4、显影染色好的胶体;用蒸馏水冲洗2次;倒入显色液用前加3ml的甲醛;轻摇至显出清晰的带为止5、拍照将显好色的胶用水冲洗2次后;置于玻璃板上;在室温下拍照;用于分析处理..。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
下面是sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤：
1.准备凝胶溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合，加入去离
子水并搅拌直至溶解。
加入TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸铵，混合均匀。
2.制作玻璃板：清洗两个玻璃板，加入适量凝胶溶液，用玻璃板
夹夹住，形成模具。
等待凝胶聚合。
3.准备电泳缓冲液：混合Tris 和甘氨酸，调整pH值。
4.准备样品：将蛋白质样品与loading buffer混合，煮沸3-5
分钟。
5.上样：将样品加入凝胶顶部，用移液枪或者吸管将样品加入凝
胶的梳子底部。
6.电泳：接通电源，调节电压和电流，进行电泳。
7.转膜：将凝胶和膜一起放入电转仪中，加入Tris甘氨酸电泳
缓冲液，接通电源，进行转膜。
8.染色：将膜放入染色液中染色，用保鲜膜将染色液表面覆盖，
轻轻摇动，直至膜完全染色。
9.洗脱：将膜从染色液中取出，用去离子水洗脱。
10.分析结果：观察膜的条带，进行数据分析。
以上是基本的聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。
需要注意的是，实验操作中需要注意安全，避免对身体有害的试剂。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理和操作步骤
实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特点判断的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混杂蛋白的分子量不同样来进行分别的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水局部相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中参加强复原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂： 1. 5x 样品缓冲液〔 10ml〕: 1mol/L 的 Tris-HCl,5ml 50% 甘油，2ml 10%的 SDS，巯基乙醇， 1ml 1%溴酚蓝，蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－ 20℃保存数月。
2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺 30g，甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中， 4℃保存，一般可放置 1个月。
3.分别胶缓冲液：Tris，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调，定容至100ml， 4℃保存。
4.浓缩胶缓冲液：Tris，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调，定容至100ml， 4℃保存。
5.TEMED〔四乙基乙二胺〕原液%过硫酸铵〔用重蒸水新鲜配制〕7.Tris- 甘氨酸电极缓冲液：称取Tris ，甘氨酸，加蒸馏水约900ml，调后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8.考马斯亮蓝 G250染色液：称 100mg 考马斯亮蓝 G250，溶于200ml 蒸馏水中，慢慢参加70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌 1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
实验操作〔一〕样品制备将蛋白质样品与 5X 样品缓冲液〔 20ul ＋ 5ul 〕在一个 Eppendorf管中混杂。
放入 100℃加热 5 － 10min，取上清点样。
〔二〕分别胶及浓缩胶的制备 1将玻璃板、样品梳、 Spacer 用冲洗剂洗净，用 ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间参加Spacer ，依据 Bio-Rad MiniⅡ/ Ⅲ说明书提示装好玻璃板；3按以下体积配制 10％分别胶 ml ，混匀；ddH2O mlmol/LTris-HCl pH= ml30% Acr-Bis ml10% SDS 80 ul10%AP 56 ulTEMED 6 ul4 向玻璃板间灌制分别胶，马上覆一层重蒸水，大体20 min后胶即可聚合；5 按以下体积配制 6％浓缩胶 ml ，混匀；ddH2O mol/LTris-HClpH=30% Acr-Bisml400 ul600 ul10% SDS10% AP TEMED36ul24ul4ul6将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7装好电泳系统，参加电极缓冲液，上样 20 μl;8 稳压 200V，溴酚蓝刚跑出分别胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.9 卸掉胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～ 2 hr ；参加脱色液，置于 80 rpm 脱色摇床上 , 每20 min 更换一次脱色液〔 10 ml 冰乙酸； 45 ml 乙醇； 45 ml 蒸馏水〕至完好脱净。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，14.4-97KD）1电泳各试剂的配制1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，2.67%C)——为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide 29.2 g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide 0.8 g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。
4℃避光储存。
1.2 即10%的过硫酸铵10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。
1.5M Tris-HCl，pH 8.8称取Tris base 18.15 g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH 8.8，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
0.5%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝0.5g，去离子水定容至100mL。
0.5M Tris-HCl，pH 6.8：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH 6.8，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。
1.3 凝胶配制按下表比例配制凝胶10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。
其中：TEMED为催化剂1.4 10×电极缓冲液，pH 8.3称取Tris base 30.3 g、Glycine（甘氨酸）144 g、SDS 10.0 g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。
4℃储存。
临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。
1.5 样品溶解液S去离子水 3.55mL；0.5M Tris-HCl，pH 6.8 1.25mL；glycerol （甘油） 2.5mL10% (w/v) SDS 2.0mL0.5%（w/v）溴酚蓝0.2mL总体积为9.5 mL。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告引言聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的生物分子分析技术。
它通过应用电场，将带电的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质）在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离和测量。
本实验旨在通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析DNA分子的大小和浓度。
材料与方法1. 准备聚丙烯酰胺凝胶：将聚丙烯酰胺粉末加入缓冲液中，并加热至溶解，制备成一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶。
2. 制备样品：将待测DNA样品与DNA标记物混合，加入一定体积的加载缓冲液，并加热至退变。
3. 电泳操作：将准备好的样品注入凝胶槽，连接电源，施加一定电压使DNA分子在凝胶中移动。
4. 染色与观察：将电泳结束后的凝胶进行染色，使用紫外线透射仪观察和记录分离出的DNA带。
结果与讨论通过实验我们得到了一张聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果图。
图中展示了不同大小的DNA分子在凝胶中的分离情况。
根据DNA标记物的迁移距离和已知标准品的迁移距离，我们可以测量待测DNA样品的大小和浓度。
在实验中，我们发现较大的DNA分子在凝胶中迁移较慢，而较小的DNA分子则迁移较快。
这是因为聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，较大的DNA分子难以穿过这些孔隙，因此迁移速度较慢。
而较小的DNA分子则能够更容易地通过孔隙，因此迁移速度较快。
我们还观察到，在电泳过程中，DNA分子会受到电场的作用而带有电荷，向阳极（电场的正极）移动。
根据DNA分子的电荷量、大小和凝胶孔隙的大小，我们可以通过调整电场强度和凝胶浓度来控制DNA分子的迁移速度和分离效果。
结论通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们成功地分离和测量了DNA分子的大小和浓度。
这项技术在生物学和分子生物学研究中具有重要的应用价值，可以用于DNA测序、基因突变检测和蛋白质研究等领域。
然而，在实际应用中，我们需要注意凝胶浓度、电场强度和染色方法等因素对实验结果的影响，以确保实验的准确性和可重复性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，）1电泳各试剂的配制1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，%C)——为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。
4℃避光储存。
即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。
Tris-HCl，pH称取Tris base g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝，去离子水定容至100mL。
Tris-HCl，pH ：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。
凝胶配制按下表比例配制凝胶分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。
临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。
其中：TEMED为催化剂10×电极缓冲液，pH称取Tris base g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。
4℃储存。
临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。
样品溶解液S去离子水；0.5M Tris-HCl，pH ；glycerol （甘油）10% (w/v) SDS%（w/v）溴酚蓝总体积为 mL。
室温储存。
临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳流程
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，）1电泳各试剂的配制1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，%C)——为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。
4℃避光储存。
即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。
Tris-HCl，pH称取Tris base g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝，去离子水定容至100mL。
Tris-HCl，pH ：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。
凝胶配制按下表比例配制凝胶分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。
临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。
其中：TEMED为催化剂10×电极缓冲液，pH称取Tris base g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。
4℃储存。
临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。
样品溶解液S去离子水；0.5M Tris-HCl，pH ；glycerol （甘油）10% (w/v) SDS%（w/v）溴酚蓝总体积为 mL。
室温储存。
临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
常用的硅化剂为二氯二甲基硅烷 （dichlorodimethyl silane）,商品名为Siliconisel25。为了灌胶时不漏胶，可在封边条和玻璃板之 间涂医用凡士林，也有人用冷却至50℃的1%琼 脂糖凝胶封堵缝隙。或用胶带纸或医用橡皮膏将 玻璃板的三个边缘封贴。 三、制胶 根据所需的凝胶浓度配制凝胶溶液，参见表 4.7，灌胶前加入TEMED。
§4. 3. 2 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（continuous electrophoresis）是1959年L.Weintraub和 S.Raymond最早创立的，是指电泳系统采用相同孔 径的凝胶和相同的缓冲液（包括样品缓冲液、凝胶 缓冲液和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度不 同的条件下进行区带电泳。
C = 6.5－0.3T
（4.14）
此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C 值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围 约为 ±1％。
当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加 而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最 小。C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大 于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的 C是2.6％和3％。
该技术是利用样品（如蛋白质）的电荷效 应进行分离的，而凝胶的分子筛效应不明显。 一般只用于分离简单的样品，分辨率不高。 但由于其具有制胶简便、快捷、缓冲系统组 成简单、 pH 恒定等优点，至今还有部分实 验在使用该方法。
§4. 3. 3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（discontinuous electrophoresis，也称为圆盘电泳）是20世纪60 年代中期由S.Hjertè n、L.Orenstein和B. J. Davis 创建并完善的电泳技术。是指使用不同孔径的 凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳过程 中，凝胶按需要在一块玻璃板内被制成不同浓 度的两部分（小的部分是浓缩胶，大的部分是 分离胶）。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE实验原理和操作步骤
S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳S D S P A G E实验原理和操作步骤The pony was revised in January 2021SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(详细参考)
Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。
Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μMDNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。
1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4. 取上清到新的EP管中。
在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；6. 重复4、5步直到上清澄清；7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。
原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。
）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。
）13. 在管中加入16μL 1*TE溶液；14. 进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
1.清洗电泳仪和电泳板。
2.准备实验用液，将需要的磷酸缓冲液和聚丙烯酰胺溶液以及添加的阳离子
表面活性剂混合均匀。
3.调节电泳仪的温度、电压、时间等参数。
4.垂直安装电泳板，将电泳板安装在电泳支架中，保证其处于垂直位置。
5.将溶液添加到电泳板，并将电泳板放入电泳仪中进行实验，注意实验过程
中溶液的变化，以便及时调节电泳仪参数。
6.实验完毕后取出电泳板，用纸巾擦拭干净，重复上述实验步骤，直至所有
实验完毕。
7.染色及脱色，电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染
色1小时以上。
染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。
置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。
此时改用7%醋酸充装在液槽中。
通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。
在我们的试验中省略的染料泳向正极。
脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。
3-4小时脱色完毕。
有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及原理a
笫八部分聚丙烯酰胺凝胶电泳一、电泳的原理电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。
在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。
电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳；1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白。
其后的几十年，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。
以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳表1 电泳技术的种类等；以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等(表1)。
电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis)是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离……这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。
电泳按其分离的原理大致可分为四类：区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)和等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)。
现将各种电泳分离原理简单介绍如下：1．区带电泳如图1(a)所示，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。
电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
【跑电泳的步骤】1取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）: +0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。
Tris-HCL（88” TEMED SDS Acry-bis,按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。
&配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙, 装去离子水，不能漏（1h）,等待。
），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V,电流20mV;16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。
【附配方】分离胶separating gel (5mL) ( 1 个板1板2板Prescriptio n12%10%%mL mL Del H2O mL mL3mL1.5M Tris-HCL mL mL mL mL mL30%Acry/bis 2 mL mL mL mL单体胶(29.2g+0.8g/100mQ10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL10%AP50uL50uL50uL35uL70uL7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uLuL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)Preseriptio n Volume(2 mL)(2 mL)Del H200.5M Tris-HCL250uL375uL30%单体胶330uL495uL10%SDS20uL30uL10%AP20uL30uLTEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL 夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T, %C）配制50mL:丙烯酰胺Aery: 14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；（100mL: Aery 29.2g, bis 0.8g）超纯水定容至50mL，uM 膜过滤，4C保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（mN）,可选择的范围为3%~30% %C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m）,也指交联度。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法(一)管型盘状电泳1.仪器和设备图8 管型盘状电泳槽结构A为正面B为剖面(1)分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7(3)电极缓冲液PH8.3电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。
电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在0～600v内任意调节，电流输出0～100mA，这类电泳仪比较恰当。
玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm左右，管长70～100mm。
管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。
聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。
微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。
普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。
其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平等。
2.试剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(V B2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。
丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。
(1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。
结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。
(2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备用。
3.试剂配制(1)凝胶及缓冲液配制系统有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。
列表4供参考。
最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。
各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。
用时需测PH值，以检查是否失效。
TEMED要密封贮藏。
过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。
表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统<DIV align=center>(2)指示剂配制蛋白质样品通常是无色的，为了观察和估计样品在凝胶上迁移情况，常加指示剂作为电泳迁移的可见标志。
对碱性缓冲系统，一般用溴酚蓝或酚红，对于酸性缓冲系统，一般用甲基绿或次甲基兰。
指示剂可直接加在样品中，也可加在电泳槽的缓冲液中，也可加在玻管中。
溴酚蓝通常配制成0.1%的母液备用。
(3)染色剂配制蛋白质的染色方法很多，常用的染色剂有氨基黑10B，考马斯亮蓝R250，考马斯亮蓝G250等，有关配制浓度，染色方法以及同工酶的显色方法见操作过程中的染色部分。
4.操作技术(1)凝胶制备配制凝胶前，应把玻璃管装好。
装玻管的方式很多：在凝胶架的孔洞内，加少许40%蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。
配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。
聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。
先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为①有些样品会抑制胶聚合；②光照可引起某些蛋白质变性；③多了一道手续，延长制胶时间。
分离胶的制备：按表4比例混合贮存液，(先不与过硫酸铵混合)，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。
抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。
务必勿使气泡出现。
为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地加入一层水，约3～5mm高度，消除凝胶的弯月面。
加水要小心，切勿冲乱界面。
加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。
以防影响顶部胶层的聚合。
注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。
水层放好后，静置30分钟，使凝胶进行化学聚合反应。
聚合最适温度为25℃。
当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。
界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置20～30分钟，聚合便完全。
分离胶的预电泳(此步骤应根据实验的需要决定取舍)：凝胶聚合程度一般在90%以上。
残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品(如酶)会造成钝化或引起其它人为效应。
因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，称为“预电泳”。
若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳更为重要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。
步骤：去除玻管封口，倒出玻管中凝胶上的水分，并用分离胶缓冲液洗涤一下。
把玻管插入电泳装置中。
上下电极槽中均加入分离胶缓冲液，预电泳的电流为3mA/管，时间需30分钟～2小时。
预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。
浓缩胶的制备：分离胶聚合好后，或已经过预电泳的分离胶，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。
按表4中比例混合浓缩胶液(也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用时再混匀)，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。
放在两只20W以上功率的日光灯下，约离灯管10～15cm处，光下聚合60分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。
浓缩胶应临用前制备。
(2)样品的准备聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。
例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。
初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。
盘状电泳所需要的样品是很少的。
一个标准凝胶管按体积，需要5～100μl的样品(约0.1～2mm高)；按含量需要5～100μg。
实际上就是用0.1%浓度的样品5～100μl。
由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。
对于只含有少数组分的样品，通常用10～20μg，对于含有多种组分的样品，可用到200μg。
即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。
所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于±5%。
近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%～20%的蔗糖或10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。
如果样品离子强度太高，会引起分界面模糊不清，严重时完全不能进行电泳。
因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电势梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。
硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使其电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电势梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。
如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。
玻璃管也要适当加长。
通常稀样液与浓缩胶的比不大于1∶1.2。
一个生物样品(粗抽提物)，常需要事先经过处理(高速离心，微孔滤膜过滤，柱分离等)去除沉淀，消除混浊。
或只取可溶性部分进行电泳。
不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，阻塞凝胶，干扰分离。
当样品装载量与样品溶解度不相应时，也会在浓缩胶上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象(随着电泳过程，沉淀逐渐溶解，逐渐进入)。
加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。
下槽中放满缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。
安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。
管的下端悬一滴电极缓冲液。
先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。
然后加样。
加样方法因人习惯不同而略有差异。
有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。
加样时，有的先加好样液，再在样品上加几滴缓冲液，然后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。
总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓冲液互不干扰。
(3)电泳在电泳槽中注满电极缓冲液。
缓冲液应事先在冰箱中预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。
连接直流稳压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。
缓冲系统为酸性时则相反。
Davis标准状态的凝胶电泳，负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度在0～4℃。
打开电源开关，调节电流，开始时用1～2mA/管，电泳3～5分钟后，再逐渐升高到4mA/管。
不要一开始就电流很高。
电流最好不要超过5mA/管。
太高的电流强度会造成产热量大，使分离失败。
如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程中，一般要求电流保持稳定。
电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/4距离时，就可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。
上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下PH，如PH值发生改变就不能再使用。
每次电泳后，下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电泳。
重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。
(4)剥胶为了防止电泳后凝胶中蛋白(酶)盘状区带扩散，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色，一般用20～30ml的注射器配上10cm长的针头，左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一边压水，一边使针头呈螺旋式推进。
靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，针头抽出，胶就自动滑出。
如果不出，就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。
如果胶浓度较高，取出困难，可用10%甘油水溶液代替水注入。
一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。
剥胶时应注意不要损伤胶柱表面。
(5)固定与染色为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。
剥出的凝胶柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的效果。
也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。