3-3动物微生物--病毒的鸡胚接种技术(实验四)
病毒的鸡胚培养法接种途径
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
内容提要
一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用 锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微 量移液器4支，真菌示教培养管4支）
缺陷：带毒，缺敏感动物。
常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。
接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静
脉注射等。
1 病毒的动物接种
目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎 病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ， 棉签，眼科剪等
小白鼠的脑内接种（共8只小白鼠）
病毒的培养
病毒的概念：形态最小，结构最简 单的微生物。缺乏完整的酶系统， 无完整的细胞结构，必须在活的组 织细胞中才能增殖。
常用的分离、 培养、鉴定 病毒的分离培养 病毒的方法
动物接种法
鸡胚培养法
组织细胞培养法
动物接种（Animal inoculation）
最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。
本次实验不做培养，接种完病毒，可将 鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组 织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液 （锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜 囊等的组织结构。
注意事项
消毒小白鼠时不要碰到眼睛
注射时不要扎的太深以免扎到手
磨卵壳及钻孔时力量要适中
看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的 大烧杯中
菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落
3-3动物微生物--病毒的鸡胚接种技术(实验四)
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上， 冻死胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4、羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
实验四 鸡胚接种
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低， 病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途 径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的 鸡胚接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白
羊膜腔
卵壳 卵白 尿囊腔
卵壳膜 气室
绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透 明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液 中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13 天后，尿囊液开始变得混浊。
➢羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 ➢卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 ➢卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
四、材料
1、鸡胚 10日龄 2、病毒 鸡新城疫病毒（NDV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
流感病毒的鸡胚培养,收获及血凝效价测定实验报告
篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
53动物接种试验
动物接种实验结果分析
• 结论：
– 试验鸡于接种后第2天死亡，说明该大肠杆菌分离株 具有致病性。
《动物微生物》
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断
实验室诊断结论
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断---结论
实验室诊断结论---大肠杆菌阳性
鉴定结论： 形态学检查、分离培养和生化鉴定的结 果均符合大肠杆菌特性，动物接种试验 显示该细菌分离株有致病性。一系列试 验结果表明送检病料中有致病性大肠杆 菌感染。
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断---结论 大肠杆菌：+
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断---动物接种
实验目标
• 验证大肠杆菌分离株是否有致病性
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断---动物接种
实验器材
• 大肠杆菌纯培养物 • 1mL注射器 • 碘酊棉球 • 酒精棉球 • 镊子等
综合实训 大肠杆菌病的实验室诊断---动物接种
动物接种试验方法---腹腔注射
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
实验鸡胚接种
实验鸡胚接种
xx年xx月xx日
CATALOGUE
目录
实验准备实验步骤实验数据分析实验结论实验讨论与展望
01
实验准备
1
实验人员要求
2
3
了解微生物的种类、特点、致病性及检验方法等。
具备微生物学基础知识
熟悉接种、分离、培养、鉴定等实验操作规范，并能够熟练操作。
掌握实验操作技能
遵守实验室的各项安全规章制度，注意个人防护和实验室废弃物的处理。
培养时间
根据实验需要，确定鸡胚培养的时间，以便观察和记录实验结果。
鸡胚培养
03
实验数据分析
数据记录
记录实验进行的日期。
实验日期
记录所使用鸡胚的编号，方便追踪。
鸡胚编号
记录接种的病毒或细菌剂量。
接种剂量
记录鸡胚在实验过程中表现出的症状和时间。
症状表现
数据转换
将非数值型数据进行转换，以便进行数学分析。
多样性
根据实验需求，选择不同品种、来源的鸡胚，以满足实验的多样性和代表性。
鸡胚选取
选用精细、锋利的接种针，灭菌烘干后备用。
鸡胚接种
准备接种工具
将鸡胚固定在操作台上，用接种针在鸡胚的尿囊膜上选择适宜的位置，进行无菌接种。
接种操作
接种后对鸡胚进行密封处理，以防止外界微生物的侵入。
接种后处理
培养环境
为鸡胚提供适宜的温度、湿度和气体环境，以保证鸡胚的正常发育和繁殖。
数据清洗
去除异常值、缺失值和重复数据，确保数据准确性。
数据聚合
将多个数据源的数据聚合在一起，以便更全面地评估实验结果。
数据处理
03
结论提取
基于分析和解释，提取有关实验的结论，为后续研究提供参考。
《动物微生物》课程标准
《动物微生物》课程标准课程名称：动物微生物课程类别：专业基础课程课程学时：72课程学分：4一、课程性质与任务《动物微生物与免疫技术》是动物医学、动物防疫与检疫等专业的专业基础课程，在动物防疫与检疫、畜牧生产和疾病诊断与防控方面具有重要的地位和作用，可为学生学习《禽病防治》、《猪病防治》、《牛羊病防治》、《宠物疾病防治》、《兽医卫生检验》、《动物防疫与检疫技术》等专业课程打下良好的基础。
学好本课程能让学生掌握实用、够用的理论知识和多种贴近生产实践的技能，能够达到技能熟练、知识丰富、解决问题到位、具有一定的自主学习能力和创新能力，具备相应岗位的知识、能力和职业素质。
同时，我们将德育教育有机融入课堂，贯穿学习的全过程，使学生树立“欲做事，先做人”的思想，建立正确的人生观，明显提高了学生的专业素养和可持续发展能力。
本课程具有基础性强、技术性强、应用性强三大特点。
课程中训练的动物微生物检验技术和免疫学技术都是直接应用于生产的技能，是畜牧生产、疫病防控的重要技术支撑，是学生毕业生产实习与顶岗训练的重要准备和演练，在生产中广泛应用于兽医化验室、兽医技术服务、养殖场生物安全等生产环节；训练内容为职业技能鉴定中动物疫病防治员、动物检疫检验工、兽医化验员等工种的鉴定项目。
通过本课程的学习，要求学生能够完成以下工作任务：能利用所学理论知识和技能正确诊断细菌病、病毒病等传染性疾病；能正确消毒与灭菌；能利用生物制品进行免疫预防和治疗。
二、课程教学目标通过本课程的学习，要求学生能够掌握高等畜禽疫病防治人员、动物检疫检验人员、兽药生产与营销人员、技术推广人员所必需的动物微生物检验和免疫的基本知识与技能。
（一）知识目标1.掌握细菌病的实验室诊断方法。
2.掌握病毒病的实验室诊断方法。
3.掌握消毒与灭菌的方法，了解物理因素、化学因素和生物因素对微生物的影响及其在生产上的应用。
4.掌握特异性和非特异性免疫的基本原理。
5.掌握免疫诊断的原理、方法和临床应用。
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种教学目标使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。
材料准备1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。
2.种毒新城疫病毒悬液。
3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。
4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。
方法步骤（一）鸡卵的保存、孵育及检卵1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。
2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。
将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。
3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。
鸡胚的生长情况分为以下几类：（1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
（2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。
（3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。
（4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。
（二）各种途径的鸡胚接种方法1.尿囊腔接种（1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。
在气室中心或远离胚胎侧气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。
以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。
孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24 h内死亡的鸡胚。
实图6-20鸡胚的结构实图6-21尿囊腔接种（2）收获方法收获时间须视病毒的种类而定。
新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。
病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法
小白鼠滴鼻感染法（示教）
• 【材料】 • 小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消 毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物 罐等。 • 【方法】 • 1 ．首先将小白鼠 1 只投于带盖的，内放有浸 蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻 醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易 遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴 注时打喷嚏。
二、标本的处理
• （一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位 /毫升，置4℃过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/ 毫升，置4℃作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、 呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入 等量的乙醚4℃过夜除菌。
• （二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研 磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液 （PH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水 或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织 悬液，然后经2000转／分离心20分钟。 必要时可加抗生素处理（同上）。
尿囊腔接种
• 【材料】 • 新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，10—12日 龄鸡胚，卵垫， 1 毫升无菌注射器及 14 号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针， 眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌 生理盐水，碘酒，酒精棉球。
• 【方法】 选9—11日龄鸡胚，照检后划出气室和胎 位，在气室边缘上2—8毫米处避开血管 作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻 钻一小扎（勿损伤壳膜），用注射器注 入病毒0.1—0.2毫升，然后用溶化石蜡 封口，置33—35℃孵育（时间见表12— 6）。
二、病毒的鸡胚接种、培养与 收获
• （一）接种 实验室经常应用的接种途径有四种： 绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊 接种等。（见表12—6）
• 2．用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食 指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位 置，另 一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口 而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴 靠至动 物鼻尖，动物在呼吸时带人，一般滴入0.03— 0.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内， 容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内 死亡。 • 3．动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在 数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳 嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有 肺炎或出血性病灶。
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的要求掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。
二、器材1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。
实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。
2.接种材料新城疫I系疫苗3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。
三、内容和方法（一）接种前的准备1.鸡胚的准备本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、 1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。
2.病毒接种材料的准备要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1小时或冰箱中12—24小时处理。
或经滤器除菌。
（二）接种绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。
（三）收获新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。
收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。
碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存。
【医学实验】禽流感病毒的鸡胚培养法 PPT课件
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清
的培养基，终止蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。
在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛，大多能维持二倍体核型 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代期早期 冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转 化
衰退期： 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至
完全停止，细胞进入第三期衰退期。
细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。
取材注意事项
1. 取材要准确 2. 因“材”制宜进行处理 3. 保持湿润 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤 5. 动作快，耗时越少越好，必要时可以使用低温（4℃） 6. 取材应注意组织类型、分化程度、供体年龄等。取材时应尽量
选用易培养的组织进行培养 7. 原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的
实验材料及器械
1. 已接种流感病毒的十日龄鸡胚 2. 无菌镊子、眼科剪刀、玻璃吸管、无 菌EP管（1.5和10mL各一个） 3. 75％酒精棉球
实验方法与步骤
1. 收获时间根据不同的病毒而异，流感病毒一 般培养36～48小时即可进行收获。收获前一 天晚上，将鸡胚于4℃冰箱过夜（如果急于 收获亦可于－20℃放置1小时左右），将鸡 胚冻死，使红血球凝固，这样可避免在收获 时流出的血细胞，同尿液或羊水里的病毒发 生凝集，造成病毒滴度的下降。
病毒的鸡胚培养法
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养
实训四病毒的鸡胚接种技术.ppt
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
鸡胚结构示意图
1. 气室 8.羊水腔
2. 胚壳
9.绒毛尿囊膜
3. 卵黄囊
4. 清蛋白
5. 尿囊腔
6. 壳膜
7. 胚体
实训四 病毒的鸡胚接种技术
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 照蛋
以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及 日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡 胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘， 避开大血管。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
实训四 病毒的鸡胚5%碘酊棉球和75%酒精棉从中央 向四周进行消毒。
• 打孔
用灭菌的锥子在事先消毒的部位打一小孔。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 接种NDV
无菌操作用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插 入气室,刺入尿囊腔，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。
• 封孔
接种病毒完成后，用熔化的石蜡将小孔封闭。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 继续孵化与照胚
封孔完成后，将鸡胚置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每 6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的 鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜 （气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱 冻死（新城疫Ⅳ系疫苗株一般培养至72小时）。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
四、病毒的收获
实训四 病毒的鸡胚接种技术
四、病毒的收获
绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。 将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳 膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开 或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管 从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。
食品生物技术《实验三 动物病毒的鸡胚培养》
实验三动物病毒的鸡胚培养一、实验目的掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用三、器材1．病毒痘苗病毒〔Vaccinia virus〕，鸡新城疫病毒〔Newcastle distase virus〕。
2仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，25％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡〔固体石蜡加1／4凡士林，溶化〕，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3白壳受精卵〔自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好〕。
四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育〔37℃，相对湿度是45%~60%〕，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比拟大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d 后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供给缺乏，会导致鸡胚大量死亡。
2接种〔1〕绒毛尿囊膜接种℃将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
℃用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形〔每边约5~6mm〕的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
℃用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜别离。
℃用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室〔图℃—4〕。
℃用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴005~痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。
鸡胚接种方法
鸡胚培养法的缺点：
1. 一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指 征。 2. 卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。 3. 某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传 递到鸡胚。 4. 通常鸡胚常常含有白血病病毒。 5. 在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡 胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵 抗。
检卵
在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到4－5天 后才容易看见。因此，检卵要在孵育4－5天 后进行。活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显， 上面的血管清晰可见、成网状，可看到明显 的胚胎自主运动。如果胚胎活动呆滞或不能 自主运动，血管模糊、变细、折断脱落，绒 毛尿囊膜界线模糊，说明鸡胚已濒临死亡或 已经死亡。
接种前后都要检卵。接种前 检卵是要了解鸡胚的存活情况， 标记气室边界和胚胎位置；接种 后检卵是为了观察接种后胚胎的 状况。
发育正常胚与异常胚的辩别
1、正常胚 头照可见眼点明显，血管色鲜红，呈 放射状；二照可见整个蛋除气室外均布满鲜红 血管（合拢）三照时蛋的小头看不到发亮部分 （封门），气室界线边缘血管鲜红。 2、弱胚蛋 头照胚体小，呈低阶段纤细血管，眼 点不明显；二照可见小头有0.5cm2以上区域无 血管分布；三照时小头发亮，气室界线边缘的 血管面较大。
第5天
胚长1.0cm，胚重 0.13g，生殖腺已性 分化，组织学上可确 定胚的公母，胚极度 弯曲，整个胚胎成 “C”形，可见指（趾） 原基，眼的黑色素大 量沉着，照蛋时可明 显看到黑色的眼点， 俗称单珠或黑眼；
病毒分离培养
方法
应
用
价
值
存 在 问 题
自身带病毒； 有的接种后不敏感； 动物饲养问题 敏感病毒谱窄 设备技术要求条件高
应用最早； 动物 方法简便； 接种 结果易于观察 鸡胚 来源客观，易于管理，带 培养 病毒机会少；多途径接种 细胞 应用广泛，敏感病毒谱广 培养
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六、孵育
➢孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ ➢相对湿度：50%-60% ➢必须保证有充分的新鲜空气流通，特别是在孵
化5-6天以后 ➢从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
七、检卵
➢自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。 ➢孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育
情况。 ➢未受精卵：只见模糊的卵黄阴影，不见血管和
鸡胚痕迹 ➢活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚
还可见到胚动，但孵育14、15天以后胚动不明 显，甚至无胚动。 ➢死胚：血管昏暗模糊，没有胚动。
八、接种前处理
➢用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室 和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。
➢对鸡胚进行消毒。
九、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点
7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗 中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小 孔用石蜡密封。 8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病
毒、新城疫病毒的分离和增殖。 1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位 2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒 3、用钢锥穿一小孔 4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入 0.1-0.2ml接种物 5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻 卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
方法一： 1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒 2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）用胶布或透明胶纸封闭切口
方法二：（要做人工气室） 1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用 电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
➢组织分化程度低，病毒易于增殖 ➢可选择不同的日龄和接种途径 ➢感染病毒的组织和液体中含大量病毒 ➢容易采集和处理 ➢来源充足 ➢设备和操作简便易行
（二）缺点
➢胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊
髓炎病毒 ➢母源抗体 ➢许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
十、接种途径 1、尿囊腔接种 2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊接种 4、眼球接种 5、羊膜腔接种 正粘病毒和副粘病毒 6、脑内接种 狂犬病毒 7、静脉接种 蓝舌病毒
羊膜腔
卵壳 卵白 尿囊腔
卵壳膜 气室
绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透 明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液 中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13 天后，尿囊液开始体浸泡于其中 ➢卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 ➢卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
四、材料
1、鸡胚 10日龄 2、病毒 鸡新城疫病毒（NDV） 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
（一）卵黄囊接种法 主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次
氏体等的分离和增殖。 方法一： 1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位 置2）后用，碘垂酊直和放酒置精在消卵毒座气上(大头向上) 室端 3）用钢锥在气室中央锥 一 小孔
4） 用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小 孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育， 每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
方法二： 1）2）同一 3）将卵横放在卵座上， 胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒 精消毒。
4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm， 注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵 育，24h内死亡者废弃
（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
2、用碘酊和酒精消毒后， 小心用刀尖撬起卵壳，造 成卵窗。 3、在气室端中央钻一个 小孔。 4、用针尖挑破卵窗中心 的壳膜，切勿损伤其下的 绒毛尿囊膜，滴加生理盐 水于刺破处。
5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造 成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷 而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理 盐水迅速渗入。 6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜 上。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上， 冻死胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4、羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
实验四 鸡胚接种
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低， 病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途 径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的 鸡胚接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白