《分子生物学与临床》PPT课件

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二.外源性物质
1.标本溶血 2.标本受细菌污染 3.标本保存不当 4.标本凝集不全 5.标本管中添加物质的影响
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PCR测定的临床应用及 测定结果的临床意义
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PCR在诊断病原体感染时的优缺点
优点：
1. 灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就 可以作出诊断。
2. 特异性强，对于一个19核苷酸的引物来说，非特异性配对的 概率为419 = 2.75*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相 同时需要的基因组DNA片段的最小长度，而人的基因组长度为 3*109碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。
玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的 RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性 失活。
全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的 抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而 且在其后的核酸提取步骤中很难去除。
临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝 处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如 未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。
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二.标本的稳定化处理
用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理， 但标本应及时送至实验室。
由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须 进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐 （Guanidine thiocyanate,GITC）可使 DNA酶和RNA酶立即失活， 因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加 至含有5mol/L GITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶 不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮 寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何， 要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。
3. 可以早期诊断，如在HCV的感染中，第一周内就可以检测出 HCV RNA，而抗体的产生一般在第二周以后。
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4. 对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无 抗体产生者，PCR却可以作出明确诊断。
5. 可以对病原体作定量分析，反映病原体在机 体的复制及动力学变化情况。
6. 可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。
分子生物学与临床
天津市第三中心医院 刘树业
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PCR技术在临床实验室应用的价值
随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR） 技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方 面的诊断。
1 . 检测临床标本中病原体核酸序列。 2 . 肿瘤基因突变情况。 3 . 遗传性疾病的基因序列。 4 . 人类白细胞表面抗原（HLA）配型。 5 . 法医学方面的鉴定工作。
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三.标本的运送
标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的 标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的 EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化 处理的标本，通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载 标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必 须速冻后，放在干冰中运送。
当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的
是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为
RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充
分的稳定化处理(血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/L GITC的试管
内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取试剂的
RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现
有RNA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标
本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的
商品核酸提取试剂。
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一.内源性物质(影响因子）
1.类风湿因子 2. 补体 3.嗜异性抗体 4.嗜靶抗原的自身抗体 5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体 6.交叉反应物质 7.标本中其它成分的影响
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四.标本的贮存
临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。用 于DNA测定的已纯化核酸样本可在10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液（pH 7.5-8.0）中4℃保存，用于 RNA 测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。 用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用 GITC处理的 RNA标本在室温可保存7天。
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不足之处:
1.操作复杂，技术不易被熟练掌握。 2.价格昂贵。 3.出于敏感性太高，操作步骤多而复杂，即使有极少
量的污染也会造成假阳性。 4.由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有
差错就会出现假阴性。
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Leabharlann Baidu点认识
一.今后仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自 动化；
二.样品采集方式对PCR很重要，比操作更重要。 三.内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。 四.从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本
同步进行；
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五.禁用产物的电泳分析技术。 六.探针杂交技术和防污染技术的采用是一大
进步。
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一.标本的采集
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血 或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样 本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采 样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样 者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。
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五.标本的处理（核酸提取）
标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在 使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进 行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是 由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血 红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂 （如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强 烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。