叶绿体色素的提取及理化性质的定稿2
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（2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下 呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出 暗红色的光。 寿命长（10-2秒——10-3秒）
叶绿素a 、b，β-胡萝卜素和叶黄素 的紫外-可见吸收光谱图
皂化反应
Chla、Chlb 是双羧酸的酯
叶绿体色素的提取及 理化性质的鉴定
授课人: 廖鹏飞
一、实验目的及要求
掌握提取和分离叶绿体中色素的方法 了解叶绿素的物理和化学性质
二、相关知识和实验原理
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡 萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、 β−胡萝卜素和叶黄素四种 。
表6-1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量
人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿 色植物标本。
类胡萝卜素(Carotenoids)是一类不饱和的四萜 类碳氢化合物，胡萝卜素有三种异构体，即α-、 β−和 γ−胡萝卜素，其中 β−胡萝卜素含量最多， 也最为重要。β− 胡萝卜素还具有维生素A的生 理活性，其结构是由两分子维生素A在端链失 去两分子水结合而成。在生物体内，β−胡萝卜 素受酶催化氧化即形成维生素A。
脂溶性: 卟啉环头部呈极性, 具亲水性; 叶醇尾 部具亲脂性, 难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已 醚、已烷等有机溶剂。
叶绿素的物理、化学性质
光学特性
（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变 化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640——660nm 红光部分 叶绿素特有 410——470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有
2、纸色谱法分离叶绿体色素
(1) 取一张层析滤纸，在中心打一个圆形小孔另取一张5-6cm 长，2-3cm宽的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿 长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度限制在 0.5cm以内），风干，重复4-5次。 风干后沿长度方向卷 成纸捻。
(2) 将纸捻的点样端插入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤 纸平齐。立放于培养皿上, 培养皿内装有层析液 ,纸芯的另 一端浸入层析液中。
项目
色素名称
叶绿素
类胡萝卜素
叶绿素a 叶绿素b β−胡萝卜素 叶黄素
颜色
蓝绿色 黄绿色 橙黄色
黄色
在叶绿体内各色素含量比例
3
1
3
2
1
1
叶绿素(Chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植 物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转 变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所 必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a （C55H72O5N4Mg）和叶绿素b （C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在， 其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中 的醛基所取代。
一个羧基被甲基酯化
可发生皂化反应
另一个羧基被叶醇基酯化
C32H30ON4Mg
COOCH3 + 2KOH
COOC20H39
C32H30ON4Mg
COOK COOK
+ CH3OH+C20H39OH
ຫໍສະໝຸດ Baidu代反应
卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、Zn2+取代， 被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色。用酸处理叶 片，H+易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶 绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离 子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。
叶绿素的基本结构见图6-1
CH2
CH
R
H3C
CH2CH3
N
N
叶 绿 素 a (R=CH3)
Mg
N
N
叶 绿 素 b (R=CHO)
H3C
CH3
CH2
O
CH2 CO2CH3 CH3
CH3
CH3
C
O
O
CH3 CH3
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四 个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁 原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯 环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿 素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成 COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长 链。
(3) 盖上皿盖, 静置观察。15min左右色素可充分扩展, 分离结 束，在滤纸上可得到各种色素的同心圆环。
六、叶绿素理化性质的观察
(1) 光对叶绿素的破坏作用 在 2支具塞试管中各放入2ml上述色素提取液，盖好塞子。
一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经 2~3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光 度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。 (2) 叶绿素的荧光
叶绿素a和b、β−胡萝卜素、叶黄素都是难溶于 水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机 溶剂溶剂。根据它们在有机溶剂中的溶解特性， 可将它们从植物叶片中提取出来。
纸色谱法是分离叶绿体色素最简单的方法，它是以
滤纸为惰性支持物，滤纸纤维一般能吸收约20 % 的 水分，其中有6~7 % 以氢键形式与纤维素上的羟基 结合，构成纸色谱的固定相。利用混合色素中各个 成分物理、化学性质的差别，在展开过程中，被分 离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配，并以 不同的速度移动，达到相互分离的目的。
1、叶绿体色素的提取
（1）将新鲜绿色植物叶片洗净擦干，去叶柄及中脉， 称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少 许固体碳酸钠和10ml乙醇，加少量的石英砂，迅 速研磨成匀浆，再加 10ml乙醇充分研磨提取叶 绿素。
（2）在玻璃漏斗底部垫一滤纸，将匀浆过滤到烧杯 中，即为色素提取液。放于暗处备用。
叶黄素(3，3`-二羟基-α-胡萝卜素，lutein， C40H56O2)是一种常见的氧化型的类胡萝卜素。
β−胡萝卜素和叶黄素的结构式如图6-2
H3C CH3
CH3
CH3
H3C
R
CH3
CH3
H3C CH3
R
CH3
β-胡 萝 卜 素 （ R=H）
叶 黄 素 （ R=OH）
维生素A
CH2OH
类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸 收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护 叶绿素分子不被氧化或阳光破坏。
四、实验器材
材料与试剂：
菠菜、空心菜等绿色植物、脱脂棉等、固体碳酸钠 或碳酸钙、石英砂、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和 NaCl水溶液、醋酸铜结晶、NaOH-甲醇溶液等。
层析液配方：
石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml
仪器设备：
天平、水浴锅、镊子、玻璃漏斗、分液漏斗、研钵、 有塞试管、等等。
五、实验方法与步骤
叶绿素a 、b，β-胡萝卜素和叶黄素 的紫外-可见吸收光谱图
皂化反应
Chla、Chlb 是双羧酸的酯
叶绿体色素的提取及 理化性质的鉴定
授课人: 廖鹏飞
一、实验目的及要求
掌握提取和分离叶绿体中色素的方法 了解叶绿素的物理和化学性质
二、相关知识和实验原理
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡 萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、 β−胡萝卜素和叶黄素四种 。
表6-1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量
人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿 色植物标本。
类胡萝卜素(Carotenoids)是一类不饱和的四萜 类碳氢化合物，胡萝卜素有三种异构体，即α-、 β−和 γ−胡萝卜素，其中 β−胡萝卜素含量最多， 也最为重要。β− 胡萝卜素还具有维生素A的生 理活性，其结构是由两分子维生素A在端链失 去两分子水结合而成。在生物体内，β−胡萝卜 素受酶催化氧化即形成维生素A。
脂溶性: 卟啉环头部呈极性, 具亲水性; 叶醇尾 部具亲脂性, 难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已 醚、已烷等有机溶剂。
叶绿素的物理、化学性质
光学特性
（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变 化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640——660nm 红光部分 叶绿素特有 410——470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有
2、纸色谱法分离叶绿体色素
(1) 取一张层析滤纸，在中心打一个圆形小孔另取一张5-6cm 长，2-3cm宽的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿 长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度限制在 0.5cm以内），风干，重复4-5次。 风干后沿长度方向卷 成纸捻。
(2) 将纸捻的点样端插入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤 纸平齐。立放于培养皿上, 培养皿内装有层析液 ,纸芯的另 一端浸入层析液中。
项目
色素名称
叶绿素
类胡萝卜素
叶绿素a 叶绿素b β−胡萝卜素 叶黄素
颜色
蓝绿色 黄绿色 橙黄色
黄色
在叶绿体内各色素含量比例
3
1
3
2
1
1
叶绿素(Chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植 物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转 变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所 必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a （C55H72O5N4Mg）和叶绿素b （C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在， 其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中 的醛基所取代。
一个羧基被甲基酯化
可发生皂化反应
另一个羧基被叶醇基酯化
C32H30ON4Mg
COOCH3 + 2KOH
COOC20H39
C32H30ON4Mg
COOK COOK
+ CH3OH+C20H39OH
ຫໍສະໝຸດ Baidu代反应
卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、Zn2+取代， 被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色。用酸处理叶 片，H+易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶 绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离 子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。
叶绿素的基本结构见图6-1
CH2
CH
R
H3C
CH2CH3
N
N
叶 绿 素 a (R=CH3)
Mg
N
N
叶 绿 素 b (R=CHO)
H3C
CH3
CH2
O
CH2 CO2CH3 CH3
CH3
CH3
C
O
O
CH3 CH3
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四 个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁 原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯 环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿 素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成 COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长 链。
(3) 盖上皿盖, 静置观察。15min左右色素可充分扩展, 分离结 束，在滤纸上可得到各种色素的同心圆环。
六、叶绿素理化性质的观察
(1) 光对叶绿素的破坏作用 在 2支具塞试管中各放入2ml上述色素提取液，盖好塞子。
一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经 2~3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光 度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。 (2) 叶绿素的荧光
叶绿素a和b、β−胡萝卜素、叶黄素都是难溶于 水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机 溶剂溶剂。根据它们在有机溶剂中的溶解特性， 可将它们从植物叶片中提取出来。
纸色谱法是分离叶绿体色素最简单的方法，它是以
滤纸为惰性支持物，滤纸纤维一般能吸收约20 % 的 水分，其中有6~7 % 以氢键形式与纤维素上的羟基 结合，构成纸色谱的固定相。利用混合色素中各个 成分物理、化学性质的差别，在展开过程中，被分 离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配，并以 不同的速度移动，达到相互分离的目的。
1、叶绿体色素的提取
（1）将新鲜绿色植物叶片洗净擦干，去叶柄及中脉， 称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少 许固体碳酸钠和10ml乙醇，加少量的石英砂，迅 速研磨成匀浆，再加 10ml乙醇充分研磨提取叶 绿素。
（2）在玻璃漏斗底部垫一滤纸，将匀浆过滤到烧杯 中，即为色素提取液。放于暗处备用。
叶黄素(3，3`-二羟基-α-胡萝卜素，lutein， C40H56O2)是一种常见的氧化型的类胡萝卜素。
β−胡萝卜素和叶黄素的结构式如图6-2
H3C CH3
CH3
CH3
H3C
R
CH3
CH3
H3C CH3
R
CH3
β-胡 萝 卜 素 （ R=H）
叶 黄 素 （ R=OH）
维生素A
CH2OH
类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸 收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护 叶绿素分子不被氧化或阳光破坏。
四、实验器材
材料与试剂：
菠菜、空心菜等绿色植物、脱脂棉等、固体碳酸钠 或碳酸钙、石英砂、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和 NaCl水溶液、醋酸铜结晶、NaOH-甲醇溶液等。
层析液配方：
石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml
仪器设备：
天平、水浴锅、镊子、玻璃漏斗、分液漏斗、研钵、 有塞试管、等等。
五、实验方法与步骤