纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测
RP_HPLC法测定发酵液中纳他霉素含量
文章编号:1001-8689(2004)11-0653-04RP -HPLC 法测定发酵液中纳他霉素含量骆健美1,2 金志华1,2 岑沛霖1* (1浙江大学化学工程与生物工程学系, 杭州310027;2浙江大学宁波理工学院生物与制药工程系, 宁波315100) 摘要: 目的 建立测定发酵液中纳他霉素含量的反相高效液相色谱法。
方法 发酵样品用甲醇萃取后进样。
用Hy per sil BDS C 18(5 m,4.6mm ×200mm )色谱柱分离,流动相为甲醇-水-冰乙酸(60∶40∶5,体积比),流速为1.00ml /min ,紫外检测波长302nm 。
结果 该方法的日内R SD 为0.15%(n =6),日间RSD 为0.90%(n =6);对照品浓度为92、184、368 g/ml 时,加样回收率分别为:99.84%,101.18%,101.41%。
结论 本法具有操作简单、快速测定、灵敏度高、专属性好和准确性好等优点,可有效地控制纳他霉素的质量。
关键词: 纳他霉素; 发酵液; 反相高效液相色谱法中图分类号:R 917 文献标识码:A收稿日期:2004-05-25 修回日期:2004-06-10作者简介:骆健美,女,生于1978年,在读博士研究生。
从事抗生素方面的研究。
*通讯联系人,E-mail:cenpl@ 纳他霉素(natamy cin ,又称pim ar icin )为多烯烃大环内酯类抗真菌抗生素,系褐黄孢链霉菌发酵产生[1～3]。
由于纳他霉素对真菌性角膜炎有较好的疗效,因此,国外早已将此药作为真菌性角膜炎一线治疗药物,国内该药使用很少[4]。
在纳他霉素产生菌的菌种选育和发酵工艺研究过程中,需要建立一种对纳他霉素组分和含量的快速检测方法。
目前,已报道的检测方法中,生物检定法[5]对环境因素(温度、无菌条件等)、材料因素(菌种、培养基等)、操作技术要求较高,测试过程较繁杂,并且在发酵异常时误差很大;薄层层析法[5]主要用于定性分析;紫外分光光度法多作为常规对照,若用于定量分析,对条件要求较高[5,6];HPLC 法[6～8]多集中于食品中纳他霉素残留量及高纯度纳他霉素产品的检测分析。
高效生物防腐剂纳他霉素发酵的研究
为种子 液 ，
１３ 发 酵
５ 的 种 子 液 接 种 发 酵 培 养 基 ｌＯ ％ Ｏ ｍｌ置 于
５ ０ｎ 三 角 瓶 中 ， 廉 培 养 ， ０ ｒ ｍｉ ２ ℃ ， ６ １ ０ ０ ｒｌ 摇 ２ ０ ／ ｎ、 ９ ９ － ２ｈ
中图 分 类 号 ：￣ ２ ２ 文 献 标 识码 ：Ａ ￥０ ３ 文 章 编 号 ：１０ — ３ ６ ２０ １ｏ ５＿ ２ ０ ２ ０ ０ （０ ２ ０ — ０７ ０
后终 止发 酵 ＝
１４ 分 析 方 法 ．
纳 他霉 素 是 一种 抗 菌 剂 ， 对 真 菌 、 母 、 它 酵 某 原 生 动物 和某些 藻 类 有 效 ， 有 抗 细菌 活 性 没 纳 他 高 压 液 相 色 谱 法 。 Ｉ
２ 结 果 与讨 论
２１ 碳 源 的 比较 结 果 ．
２ １ １ 不 同 碳 源 的 比 较 结 果 由 表 ｌ可 知 ， 前 面 ． ．
霉 素 可 以 用 于 治 疗 、 可 用 作 一 种 食 品 添 加 剂 。 当 也
它 作 为 食 品 添 加 剂 时 ， 要 在 奶 酪 、 制 品 和 葡 萄 主 肉 酒 及 果 汁 中 用 做 抗 真 菌 剂 。在 葡 萄 酒 中 能 取 代 山 梨 酸 和 其 它 抗 真 菌 剂 ， 可 使 Ｓ 的 使 用 鼍 减 少 与 它 Ｏ 传 统 的 抗 真 菌 素 比 较 纳 他 霉 素 很 低 浓 度 下 具 有 活 性 。纳 他 霉 素 是 国 内 批 准 使 用 的 仅 有 的 ＝ 种 食 品 生 物 ｒ 菌 素） 腐 剂之 一 。 抗 防 我 国 目前 尚 没 有 生 产 纳 他 霉 素 的 厂 家 ． 应 用 全 依 靠 进 口 ，所 以 填 补 我 国在 生 产 纳 他 霉 素 的 牢 白 是 追在 眉睫的 。
纳他霉素的发酵工艺纳他霉素的发酵工艺
纳他霉素的发酵工艺一、实验的目的•了解纳他霉素的发酵生产、提取过程的基本原理和方法。
•掌握用高效液相色谱法测定纳他霉素含量的方法。
二、实验原理•本实验以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）SG2002作为抗生素产生菌，经微生物发酵后合成纳他霉素。
纳他霉素难溶于水，能溶于甲醇中，因此可用甲醇作为萃取剂提取精制，然后用高效液相色谱法测定其含量。
三、实验材料•1．实验设备与仪器•恒温培养箱、摇床、高效液相色谱分析仪、三角瓶、移液管、7L全自动发酵罐、超净工作台、TDL低速离心机、普通光学显微镜、电子分析天平、pH计、YXQG02型电热式蒸汽消毒器、SBA生物传感分析仪、微量进样器、超声波清洗器。
•2．实验材料与试剂•（1）菌种•褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）SG2002•（2）培养基•活化培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白陈5，酵母粉10，麦芽浸粉10，pH7.0•种子培养基（g/L）：葡萄糖15，蛋白胨5.2，酵母粉5，NaCl10.7，pH7.5•发酵培养基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨19.5，酵母粉7，pH7.4－7.5•上述培养基湿热灭菌121℃，20min，其中葡萄糖要单独灭菌115℃，15min。
•（3）试剂与药品•葡萄糖、麦芽浸粉、琼脂条、蛋白胨、酵母粉、甲醇、结晶紫。
四、实验方法与步骤•1.褐黄孢链霉菌的发酵罐发酵•（1）菌种活化• (2)摇瓶种子•（3）发酵罐发酵[7L]2.纳他霉素的提取•(1)纳他霉素的初提•采用甲醇溶媒法，工艺见图。
(2)纳他霉素的精制•取一定重量的粗提物溶于一定量的甲醇中，超声溶解后过滤除去不溶物，采用活性炭柱法和浸泡法进行脱色，最后浓缩干燥得精制物3.纳他霉素产量测定——高效液相色谱法•(1)色谱条件•检测器：Biotronik BT3030 UV-VIS检测器；•色谱柱：Thenomenex Primesphere C18HC柱（250nm×4.6mm）；•流动相：甲醇：水：磷酸（85：15：0.15，v/v）；•流速：1mL/min；•进样量：20μL；•检测波长：303nm；•柱温：室温。
纳他霉素效价测定方法的改良及含量的快速测定
效价和含量的方法，为纳他霉素的固体发酵生产和产 为检测菌液备用。
品实际应用提供参考。
无菌条件下，准确量取 10 mL 琼脂，加入水平放
1 材料与方法
置的平板中，凝固，作为底层；另取上层培养基，待 其冷却至 50 ℃左右时，按 1:10 的比例添加上述检测
1.1 原料
菌悬液，振荡摇匀，准确量取 10 mL 培养基，迅速添 加至已铺好底层的平皿中，待其凝固，作为菌层。
收稿日期：2014-05-07
基金项目：广东省科技计划项目（2011B020305008）
中的纳他霉素含量快速测定和生物效价测定方法的未 见报道，《中国兽药典》(2005 年版)[9]收载的兽用抗生 素药品效价的微生物检定包括两种方法，即管碟法和 浊度法。目前多数使用者仍以管碟法为主。管碟法作 为抗生素效价测定的经典方法，具有它的优点，但还 存在一定的缺陷[10~12]。固体发酵中纳他霉素含量快速 测定和生物效价测定方法的与液体发酵的差别在于前 者的纳他霉素提取物中可能含有多孔载体本身的杂质 而后者没有。室温条件下，纳他霉素在水中的溶解度 很低，为 30~100 mg/L。在水和较低级醇类中，纳他 霉素的溶解度随着 pH 值的变化而变化，其中，在 pH
和管碟法测定了同一批褐黄孢链霉菌固体发酵产物纳他霉素的含量。其中高效液相色谱法和紫外分光光度法测定纳他霉素固体发酵产
物含量分别为 2351.52 mg/L 和 1979.87 mg/L，前者结果准确而稳定。后者测定准确率为 96.97%（以高效液相色谱的测定结果为 100% 计）。适用于固体发酵过程中的纳他霉素含量的快速测定。管碟法测定纳他霉素平均效价为 1979.87 mg/L。改良管碟法采用正己烷封 盖纳他霉素溶剂甲醇后，测定的平均效价达到 1990.29 mg/L，准确率由 84.20%提高到 84.64%（以高效液相色谱的测定结果为 100% 计）。采用正己烷封盖能有效控制纳他霉素溶剂甲醇的挥发性并提高管碟法的准确性和测定的浓度范围，而正己烷本身不具有抑菌效
高效液相色谱法检测运动食品中的纳他霉素
高效液相色谱法检测运动食品中的纳他霉素王亚君【摘要】建立一种快速、有效的高效液相色谱法测定运动食品中纳他霉素残留的方法.样品经甲醇提取后,采用HLB固相萃取小柱进行净化和富集.采用Waters RP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)分离,以甲醇:水:乙酸(体积比)=60:35:5作为流动相,用PDA检测器检测,外标法峰面积定量.结果表明,纳他霉素标准在0.50μg/mL~10.00μg/mL浓度范围内线性良好,相关系数r2为0.9999,检出限为10.0μg/kg,定量限为30.0μg/kg,加标回收率达到84.6%~90.5%.该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快的优点,适用于运动食品中纳他霉素残留的分离和定量检测.%A rapid and effective method was established for the determination of natamycin in sports food by HPLC. After the sample was extracted by methanol, it was concentrated and purified by HLB solid phase ex-traction column. The separation of target compound was performed on a Waters RP C18 chromatogra phic column (4.6 mm×250 mm, 5μm) using methanol:water:acetic acid(60:35:5)as mobile phase, with PDA detector and external standard method peak area quantification. The linear range of natamycin was in the range of 0.50 μg/mL-10.00μg/mL with a correlation c oefficient of 0.9999. The detection limit was 10 μg/kg and the quantitative limit was 30.0μg/kg.The recovery rate was 84.6%-90.5%. The method has the advantages of sim-ple pretreatment, good purifying effect, high sensitivity and fast detection rate. It is suitable for the separation and quantitative detection of natamycin in sports food.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)009【总页数】4页(P164-167)【关键词】固相萃取;高效液相色谱;纳他霉素【作者】王亚君【作者单位】河南财政金融学院,河南郑州450046【正文语种】中文纳他霉素（Natamycin）是一种由链霉菌发酵产生的天然抗真菌化合物，属于多烯大环内酯类，结构式如图1所示。
高效液相色谱法检测酸牛乳中纳他霉素含量的几种前处理方法比较
纳他 霉 素 （ ｔｍ ｃ ），也 称 游 链 霉 素 ，是 一 Ｎａ ｙｉ ａ ｎ 种 天然 的多烯 大环 内酯 类抗 生 素 ，是 由纳塔 尔链 霉 菌 （ｔｐｏ ｙｅ ａａ ｎｉ 经 过 发 酵 得 到 的一 种 Ｓｒ ｔｍ ｃｓ ｔｅｓ ） ｅ Ｎ ｌ ｓ 次级 代谢 产 物 。他 微溶 于 水 、 甲醇 ，溶 于稀 酸 、冰 醋酸 及二 甲苯 甲酰胺 ，难溶 于 大部 分有 机溶 剂 ，在
了几种方法的回收率、检 出限及通过滤膜难 易程度。结果表 明：方法的回收率为 ６％ １３ ６ ０％，检 出限为
００ ． ２ ｍｇ／ｋ ｇ～０． ３ ｍｇ／ｋ 。 ０ ｇ
关键 词
纳他 霉素 ；前处理 方 法 ；比较
Ａ ｓ ａ ｔ Ｄ ｆ ｒｎｃｎ ｅｔ ｔ ｎ ｏｎ ｔ ｃ ｓ ｎ ａｄ （６ ｍｇ Ｌ ２ ｍｇＬ ．ｍ ／ ，６ ｍ ／ ，１．ｍ ／ ） ｂ ｔ ｃ ｉｅｅｔｏｃｎｒ ｉ ｓｆａ ｍｙｉ ｔ ｄｒｓ ０ ４ ／ ，１ ８ ／ ，３ ｇ Ｌ ． ｇＬ ２ ｇ Ｌ ｒ ａｏ ａ ｎａ ． ２ ４ ８
１９ 我 国卫生部 正式批 准纳他 霉 素作 为食 品 防腐 ９７年 剂 。至今 该产 品 已经在 ５ ０多个 国家得 到 广泛使 用 ，
ｐ Ｈ值 高于 ９ 或低 于 ３时 ，其 溶解 度会 有所提高 ， 主要应用于乳制品、肉制品、发酵酒 、饮料果汁 、 在大 多数食 品的 ｐ Ｈ范 围内非 常稳定 ，是 一种 天然 、 方便 食 品 、烘烤 食 品等 的生 产和保 藏 。 广谱 、高效安全 的酵母 菌及霉菌等丝状真菌抑制 纳他 霉 素 的测 定 方法 主要 有生 物 效价 法 、微 孔 剂。它不仅能够抑制真菌 ，还能防止真菌毒素的产 板生物检测法 、紫外分光光度计法 、元 素分析法 、 生 。纳 他 霉 素对 人 体 无 害 ，很 难 被 人 体 消 化 道 吸 比色分析 法 、薄层 色谱 法 和液 相 色谱 法等 。生 物 效
纳他霉素生产工艺
纳他霉素生产工艺
纳他霉素（Natamycin）是一种广谱抗真菌药物，可用于食品、医药和农业领域，具有强效的抑菌、抗菌活性和低毒副作用的特点。
纳他霉素工艺的生产过程主要包括菌种培养、发酵、提取、纯化和干燥等步骤。
首先，选择高产菌株，如Streptomyces natalensis，进行菌种培养。
将菌种接种于培养基中，培养基的配方包括葡萄糖、氯化钠、磷酸盐等，以提供菌株生长和繁殖所需的养分。
接下来，进行发酵。
将培养基和菌种混合，在适宜的温度、
pH值和搅拌条件下进行发酵。
发酵过程中，菌株利用培养基
中的养分进行代谢，产生纳他霉素。
发酵结束后，进行提取。
将发酵液经过离心、滤液和超滤等步骤，去除菌体和固体杂质，获取含有纳他霉素的提取液。
提取液中还可能存在其他有机溶剂等，需要进一步纯化。
然后，进行纯化。
通过对提取液进行温和的酸碱调节、溶剂萃取和阴离子交换柱层析等操作，去除杂质，得到较纯的纳他霉素溶液。
最后，将纯化的纳他霉素溶液进行干燥。
可以采用喷雾干燥、真空干燥等方法，将溶液中的水分蒸发，得到纳他霉素粉末。
整个纳他霉素的生产过程中，需要严格控制各个环节的温度、pH值、搅拌速度、加料量等参数，以保证产出的纳他霉素质
量稳定。
此外，还需要进行质量检验，确保产品符合相关的药典标准和规定。
总结起来，纳他霉素的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取、纯化和干燥等步骤。
这些步骤需要严格控制各个参数，以保证纳他霉素的质量和产量。
纳他霉素的生产工艺在食品、医药和农业领域具有广阔的应用前景。
纳他霉素概述
第一章纳他霉素概述纳他霉素早在1955年被Struyk等人发现，他们从南非纳他州的土壤中分离到的纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）培养液中分离出了一种新的抗真菌物质，当时称为Pimaricin （匹马菌素）；4年后美国人Burns等从土壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis，并从其培养物中分离到了Tennecetin（田纳西菌素）。
此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物质，并被世界卫生组织WHO统一命名为纳他霉素（Natamycin）。
第一节纳他霉素的性质一、纳他霉素的分子结构纳他霉素为四烯大环内酯，四烯系统呈全顺式，内酯环上C9－C13部位为半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘露糖（Mycosamine）。
其化学结构式如图1-1所示。
纳他霉素是两性物质，分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数pKa值分别为8.35和4.6，等电点为6.5，熔点为280℃。
纳他霉素存在两种构型：烯醇式和酮式，这就使得其难溶于多种溶剂。
图1-1 纳他霉素的分子结构二、纳他霉素的理化性质纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌物质，呈白色或乳白色结晶粉末，含3个结晶水，几乎无臭无味。
分子式为C33H47NO13，分子量为665.75。
纳他霉素的紫外光谱如图1-2所显示，分别在290nm、303nm、318nm处有强吸收峰，280nm处有峰肩，220nm处有宽峰。
由于纳他霉素含有四烯环，因此在280～320nm之间出现吸收峰，而在220nm的最大吸收是由于纳他霉素含有发色团。
纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族形式保持弱氧化性，纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出碘。
纳他霉素酸解可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过图1-2 纳他霉素的紫外光谱碱水解作用皂化。
纳他霉素发酵生产实验报告
纳他霉素的发酵生产、别离纯化及检测〔广州大学生物工程系，广州510006 〕摘要：本实验利用褐黄孢链霉菌斜面菌种，先取约5个接种环的斜面菌种无菌接种到2瓶种子液体培养基中培养24小时，再分别在无菌条件下用移液枪吸取1mL种子培养基转接到6瓶发酵培养基，摇瓶发酵48小时后，连续3天吸取菌液进行镜检，菌液OD值测定，并利用500μg/mL的纳他霉素按照0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL加入量制定标准曲线；摇瓶发酵5天后，合并发酵液，离心获得菌泥，采用2倍菌泥体积的95%酒精，pH值在10~10.5搅拌溶解纳他霉素；离心保留上清液，上清液在Ph值在6.5，冰箱静置3h，纳他霉素在等电点析出；离心，保留产物；产物在55℃真空干燥2h，称重获得0.08g的纳他霉素。
关键词：褐黄孢链霉菌；种子培养基；发酵培养基；等电点溶解；真空干燥引言：纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，其外观白色〔或奶油色〕，为无色、无味的结晶粉末，分子式C33H47NO13，分子量为665.73。
微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。
在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高。
纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温〔100℃〕；但由于它具有环状化学结构、对紫外线较为敏感，故不宜与阳光接触。
纳他霉素活性的稳定性受PH值、温度、光照强度和氧化剂及重金属的影响，所以产品应该防止与氧化物及硫氢化合物等接触[]。
纳他霉素( Natamycin) 是由一种纳塔尔链霉菌( St rep tomy ces natal ensi s ) 发酵产生的一种二十六元多烯大环内酯类抗生素, 能有效地抑制和杀死霉菌及酵母菌,是一种安全、低毒、高效、广谱的抗真菌抗生素和天然的生物防腐剂[ 1]与其它抗菌产品相比,纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低, 可广泛应用于由真菌引起的疾病.除此之外,纳他霉素的低溶解度,可用其对食品外表进行处理以增加食品的保质期, 不影响风味和口感.目前,全球有30 多个国家批准将纳他霉素用于乳制品、肉制品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏[ 2]。
纳他霉素的提取工艺及效价测定的研究
纳他霉素的提取工艺及效价测定的研究崔文静;程书梅;张伟;袁耀武;马晓燕;李英军【摘要】通过对纳他霉素提取工艺的研究,建立了有机溶剂萃取法从湿菌体中提取纳他霉素的工艺路线和参数.发酵液经抽滤后收集湿菌体,加入适量甲醇,调节pH至10.0～10.5,离心后再调节pH至中性,经旋转蒸发结晶获得纳他霉素粗品.纳他霉素粗品再通过紫外分光光度法和管碟法效价检测,结果显示提取出的纳他霉素具有良好的生物活性.【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2010(033)001【总页数】5页(P128-132)【关键词】纳他霉素;提取;效价测定【作者】崔文静;程书梅;张伟;袁耀武;马晓燕;李英军【作者单位】河北农业大学,食品科技学院,河北,保定,071000;河北农业大学,食品科技学院,河北,保定,071000;河北农业大学,食品科技学院,河北,保定,071000;河北农业大学,食品科技学院,河北,保定,071000;河北农业大学,食品科技学院,河北,保定,071000;河北农业大学,食品科技学院,河北,保定,071000【正文语种】中文【中图分类】Q939.97纳他霉素(Natamycin)也称游链霉素、匹马霉素(Pimaricin)或海松素,是一种天然的多烯大环内酯类抗生素[1],呈白色或乳白色,几乎无嗅无味,分子式为C33H47NO13[2]。
该抗生素是一种很强的抗真菌试剂,能有效的抑制酵母菌等真菌的生长。
目前,纳他霉素主要用于乳酪制品、果酱、肉类制品(肉汤、西式火腿)、广式月饼、糕点表面、易发酵食品加工器皿表面等[3-4]食品行业以及医疗上用于治疗真菌引起的眼科疾病。
不仅可以有效防止食品腐败,还能减少真菌毒素对人类的毒害。
随着对产纳他霉素菌种及发酵生产工艺研究的不断深入,完善纳他霉素提取工艺就显得尤为重要。
专利 US6,150,143报道了一种不需要加有机溶剂的回收方法,主要是通过两个步骤完成的:a.用匀浆法,高速剪切法,超声波技术,热处理,调 pH,酶解法,表面活性剂处理。
高效液相色谱法测定食品中纳他霉素的检测方法分析
５．００ ｍＬ 于 ２５ ｍＬ 容量瓶中，用甲醇定 容于刻度，作标准系列。 甲醇、乙酸为色谱纯，其余试剂 均为分析纯，试验用水为超纯水，样 品购自本地超市。 试验条件 Ｃ１８ 反 相 色 谱 柱（５µｍ，４．６× ２５０ ｍｍ）；流动相为甲醇∶ １１％ 乙酸 溶液 ＝５０ ∶ ５０；流速为 １．００ ｍＬ／ｍｉｎ， 波长为 ３０５ ｎｍ；进样量为 １０ µＬ。 样品处理 精确称取 ５．００ ｇ 样品，置于 ５０ ｍＬ 离心管中，加入 ３０ ｍＬ 甲醇，于涡旋混 合器上混合均匀，超声提取 ３０ ｍｉｎ， 加水 １０ ｍＬ 混合均匀后置于离心机上 以 １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，上清液 过 ０．４５ µｍ 滤膜，滤液待上液相色谱 测定。
存在问题及展望
纳他霉素对真菌类有明显的抑制 作用，对细菌和乳酸菌效果不大，若 专一使用纳他霉素无法达到预期效果， 因此与其他防腐剂协同使用应是未来 的重点研究方向。 纳他霉素作为一种天然防腐剂以 其安全、健康的特点而备受人们的关 注，我国的纳他霉素产业起步较晚， 产量较低，普及率不高。随着对其研 究的逐步深入以及生产技术的逐步提 高，会极大地推动纳他霉素的普及使 用，也能更好地发挥其防腐作用。 作者简介：朱盈蕊（1986-），女， 汉族，河南邓州人，郑州市食品药品 检验所，硕士研究生。研究方向：食 品安全与分析。
试验部分
仪器与试剂 Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ 型液相色谱仪，配紫外 检测器，安捷伦科技有限公司；Ｔｅｃｈｃｏｍｐ ＣＴ１４ＲＤ高速台式冷冻离心机， 天美 （中国） 科学仪器有限公司；ＶＯＲＴＥＸ－５ 型涡旋混 合器，江苏海门其林贝尔仪器制造有限 公司；ＭＥ２０１Ｅ 电子天平，梅特勒 － 托利 多仪器 （ 上海 ） 有限公司。 纳 他 霉 素 标 准 储 备 溶 液： 精 密 称 取 纳 他 霉 素 标 准 品（ 纯 度 ＞ ９９ ％ ）０．０１０ ０ ｇ，用甲醇定容至 １００ ｍＬ， 浓度为 １００ µｇ／ｍＬ。 纳他霉素标准溶液：准确吸取标 准 储 备 溶 液 １．００ ｍＬ 于 １００ ｍＬ 容 量 瓶中，用甲醇定容至刻度，其浓度为 １ µｇ／ｍＬ。 分 别 准 确 量 取 １ µｇ／ｍＬ 溶 液 ０．２５、０．５０、１．２５、２．５０ ｍＬ 和
纳他霉素
是容器形状和容积、培养基体积、转速和培养基 粘度。
(4)微生物共培养
基因组学研究表明，某些细菌和真菌存在数条次级 代谢途径，微生物共培养可以开启这些潜在的代谢 途径，即培养环境中临近微生物的存在可能诱导次 级代谢产物的合成。 微生物共培养可以导致:增强粗提取液中的抗生素 活性;提高已知代谢产物的产量;提高已知代谢物的结 构类似物的产量;诱导生物活性成分的表达。 共培养发酵策略对于开发新型代谢产物具有很大的 潜力和价值。
纳他霉素的理化性质
纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂， 其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含 3个以上的结晶水，外观白色或奶油色，为无 色、无味的结晶粉末，分子式C33H47NO13，分 子量为665.73。
纳他霉素是一种两性物质，分子中有一个碱性 基团和一个酸性基团，等电点为6.5，熔点为 280℃。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸 及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。
纳他霉素的抑菌机理
纳他霉素是26种多烯烃大环内酯类抗真菌剂 的1种，同乳链球菌素配合使用正好互补。
能与细胞膜上的甾醇化合物反应，引起细胞 膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏， 细胞死亡。
有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存 在甾醇类化合物，故纳他霉素对细菌没有作 用。
抗微生物性质
绝大多数霉菌在0.5~6ppm下被抑制。 极个别的在10~25ppm下被抑制。 多数酵母在1~5ppm下被抑制 纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效
果较好。 对于破坏休眠细胞则需要较高的浓度。 其对真菌抱子也有一定的抑制作用。
纳他霉素的生产工艺
1.菌种
纳塔尔链霉菌 StrePtomyces natalensis 恰塔努加链霉菌 Streptomyces chattanoogensis 褐黄孢链霉菌 StrePtomyces gilvosPoreus
实验九 纳他霉素的发酵生产
实验九纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测1一.实验目的：通过摇瓶发酵生产纳他霉素，加深对好氧发酵过程中菌体生长与次级代谢产物积累的关系的认识，积累代谢调控发酵及相关产品分离纯化和分析检测的经验。
二.实验原理：纳他霉素（Natamycin）是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素(Pimaricin)。
它是由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成。
由于它能够专性地抑制酵母菌和霉菌，被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。
1.纳他霉素的结构和性质图8-1 纳他霉素的分子结构1此实验为综合性设计性实验，需至少24学时。
以下时间安排供参考。
第一周：老师做好斜面；学生领取并清洗仪器，接种斜面制备孢子，配制种子培养基。
第二周：学生在显微镜下观察孢子的形状；将斜面孢子接种到种子培养基中摇瓶培养；配制发酵培养基。
24hr后在显微镜下观察检查种子培养物的形态，将培养1天的种子接种到发酵培养基中摇瓶培养；做标准曲线。
第三周：在显微镜下观察培养物的形态，测定发酵48小时后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。
并每隔24hr在显微镜下观察培养物的形态，测定相应发酵时间后的纳他霉素含量、还原糖含量、氨氮含量。
直到发酵196小时为止。
第四周：合并所有发酵液，提取纯化纳他霉素。
第五周：按正式发表的科技论文格式完成实验报告。
纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃（分解），分子式C33H47O13，相对分子量665.75，结构式如图所示。
纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5。
纳他霉素在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为30～50mg/L。
易于溶于碱性和酸性的水溶液中。
转变为胆酸盐形式后溶解度可以迅速增加。
纳他霉素的低水溶性不利于它的生物利用度。
因为溶解的纳他霉素必须扩散到目标物的活性部位，并且和目标物结合才能发挥作用。
一种纳他霉素高效提取纯化方法[发明专利]
![一种纳他霉素高效提取纯化方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c7f8d128a1c7aa00b42acb6a.png)
专利名称：一种纳他霉素高效提取纯化方法专利类型：发明专利
发明人：江正兵,宋慧婷,马立新
申请号：CN200910222792.6
申请日：20080311
公开号：CN101709072A
公开日：
20100519
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提出了一种纳他霉素发酵培养生产中的高效提取纯化工艺方法，其步骤为：(1)将富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀；(2)对沉淀稀释；(3)在酸性条件下溶解；(4)过滤取上清液；(5)调回到中性结晶；(6)分离干燥，得到纳他霉素产品。
本发明是先将原本酸性发酵液调节至弱酸性，使纳他霉素附着与菌体，收集菌体后在酸性环境下用甲醇溶解纳他霉素，这样避免了甲醇和酸碱的大量使用，而且提高了提取的得率和纯化的纯度。
本发明综合利用有机溶剂、pH值调节和温度控制的方法，并采用残液套用二次提取、二级纯化的方法，实现纳他霉素的高效提取和纯化，提取得率达到90％，纯度达到95％。
本发明能够实现纳他霉素的低成本、高产量、高品质的生产。
申请人：湖北大学
地址：430062 湖北省武汉市武昌区学院路11号
国籍：CN
代理机构：武汉金堂专利事务所
代理人：丁齐旭
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纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测摘要：本实验利用褐黄孢链霉菌接种斜面得到该菌孢子再将其接种到种子培养基中得到发酵种子液，再将少量种子液接种到发酵培养基中进行纳他霉素发酵，得到了纳他霉素产物0.24g，并在整个实验过程定时镜检观察菌体形态变化及测量发酵产物量。
关键词：褐黄孢链霉菌；纳他霉素；发酵；纯化；镜检引言：纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素。
它是近白色至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃，分子式C33H47013,相对分子质量665.75。
纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5，其在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为30～50mg/L，易溶于碱性和酸性的水溶液，转变为胆酸盐形式后溶解度可迅速增加。
纳他霉素在发酵生产中中常用的菌种有恰塔努加链霉菌、纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌。
本次所用菌种为褐黄孢链霉菌。
发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖。
纳他霉素在以葡萄糖为碳源时产量最高。
纳他霉素能够专一性地抑制酵母菌和霉菌，故纳他霉素已被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗等。
在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源（葡萄糖）。
纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。
有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。
1.实验材料与方法1.1材料：1.1.1发酵菌种：褐黄孢链霉菌1.1.2培养基：孢子斜面培养基：酵母提取粉4g/L，麦芽提取粉10 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂20 g/L；pH7.0摇瓶种子培养基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L；pH7.0摇瓶发酵培养基：大豆分离蛋白19.5 g/L，麦芽糊精50 g/L，酵母提取粉4 g/L葡萄糖6 g/L，pH7.01.1.3实验试剂：酵母提取粉，葡萄糖，琼脂，蛋白胨，氯化钠，大豆分离蛋白，麦芽糊精，酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化剂BHA，1，2-丙二醇，纳他霉素标准品；1.1.4实验仪器：250mL三角瓶，摇床，生化培养箱，离心机，紫外分光光度计。
1.2方法：1.2.1孢子的制备：按斜面孢子培养基配方准确配好培养基，121℃灭菌15min,摆斜面冷却后置于37℃培养1～2d，备用，用斜面转接管接种，25℃培养10d，待孢子长满后，放置冰箱5d以上再用。
涂片观察孢子形态，并显微拍照。
1.2.2摇瓶种子制备：按摇瓶种子培养基配方准确配好培养基200mL，平分装在两个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。
待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。
29℃，200r/min振荡培养24h，无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。
1.2.3摇瓶发酵：按摇瓶发酵培养基配方准确配培养基600mL, 平分装在6个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。
待培养基冷却后，取摇瓶种子1mL接种，29℃，200r/min振荡培养120～168h。
每隔24h无菌取样，取1mL发酵液用于测量其303nm处OD值，另取少量涂片观察形态，并显微照相。
1.2.4OD303的测量方法：从接种后第48h开始，每隔24h从其中一瓶中取0.5mL发酵液，加入4.5mL的丙二醇，在摇床上震荡1h，12000r/min离心10min，取0.5mL上清液，再加4.5mL 蒸馏水，摇匀，用紫外分光光度计在波长303nm处测定光密度。
1.2.5标准曲线的制作：取50mg纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500ug/mL的纳他霉素原液。
按表1制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为OD303的值。
（要求相关系数R2>0.99）产物浓度计算公式为：纳他霉素含量（mg/L）=X×100×n式中，X为将所测样品的浓度，100为样品处理时两次稀释倍数之积；表1 纳他霉素标准曲线工作表管号 1 2 3 4 5 6工作溶液浓度/(ug/mL) 010********纳他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/mL 109.89.69.49.29OD303CK1.2.5纳他霉素的分离纯化：合并全部发酵液，再12000r/min离心10min。
离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积；加两倍湿菌泥体积的95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5h（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解；然后再再12000r/min离心10min，保留上清液，将上清液用1mol/L盐酸调pH6.5，静置3h（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出；最后再12000r/min离心10min，保留沉淀（产物），将产物置于55℃真空干燥2h，称重。
2.实验结果与分析2.1标准曲线制作结果：标准曲线结果如下表2所示：表2 纳他霉素标准曲线数据管号 1 2 3 4 5 6工作溶液浓度/(ug/mL) 010********纳他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/Ml 109.89.69.49.29实际工作溶液浓度/(ug/mL) 0 2 4 6 8 10OD30300.237 0.256 0.585 0.783 0.752 以上表数据作出标准曲线：纳他酶素标准曲线y = 0.0535x R 2= 0.996400.10.20.30.40.50.60.70.802468101214系列1线性 (系列1)2.2发酵液检测结果：（如表3所示）表3 定时测量OD 值数据表 培养时间/h 48 72 96 120 144 测得OD 303 0.237 0.256 0.585 0.783 0.752 纳他霉素浓度（ug/mL ） 4.4304.78510.93514.63614.0562.3菌体镜检结果:(1)斜面菌镜检图片:图1 斜面菌40倍镜检图 图2 斜面菌100倍镜检图如图1、图2可看到，此时（接种到种子培养基前）的菌体形态较小，需在100倍镜下才能看到，菌丝多分裂成芽孢，菌丝量少；由图中可以看到有大量芽孢的存在，所以接种斜面以获得菌体芽孢的目的已达到，可以进行种子培养基接种了。
(2)种子培养基中培养24h 后菌体的镜检照片:图3 种子菌40倍镜检图图4 种子菌100倍镜检图由图3可看到，此时许多芽孢已长成了菌体，菌体数量增多，菌体形态由图4可以看到此时菌体还比较小，但长成了周围有辐射状生长的短菌丝，中间一小部份实心；(3)发酵48h镜检结果:图5 发酵48h 10倍镜检图图6 发酵48h 40倍镜检图由图5可知，此时在10倍镜下就能看到菌体，说明此时的菌体较之前已大了很多倍，且在数量上也增加了很多；由图6可看到，此时菌体形态多为菌球形，即中间有一略呈圆形的密集部份，周围或某一方向上有长短不一的菌丝伸出；而菌球旁边那些菌丝碎片可能是作装片时打碎的；(4)发酵72h镜检结果:图7 发酵72h 40倍镜检图由图7可看到发酵72h后的菌体数量较发酵48h也增加了很多；菌体较48h时变大了，中部更致密周边菌丝更多更长了；(5)发酵96h镜检结果:图8 发酵96h 10倍镜检图图9 发酵96h 40倍镜检图由图8、图9可以看到，此时菌体较48h时也变大了，但中间原来致密的部分现变得较松散了，菌体在形态上也从略呈圆形变也了不规则状(6)发酵120h镜检结果:图10 发酵120h 10倍镜检图图11 发酵120h 40倍镜检图由图10、11、。
可看到，菌体周边有大量的菌丝密密麻麻的中部较边上致密。
(7)发酵144h镜检结果:图12 发酵144h 40倍镜检图由图12可看到，此时菌体数减少了，单个菌体变大了，菌体周边有大量的菌丝密密麻麻的中部较边上致密，此时的菌丝多而细；2.4纳他霉素分离纯化结果：表4 产物分离纯化结果发酵液总体积/mL 离心后上清液体积/mL 湿菌泥体积/mL 产物干重/g 410.0 320.0 90 0.242.5实验结果分析：1由纳他霉素标准曲线可知：标准曲线的线性系数为0.9964，线性关系比较强。
制备浓度梯度的纳他霉素的校准液操作比较规范，测定OD值过程比较规范。
2随着发酵时间越长，纳他霉素的生产量逐渐增多。
随着发酵液的消耗，褐黄孢链霉菌菌量不多增多。
而纳他霉素的产生是非生长偶联型，故在发酵72h之前，纳他霉素产量变化较小；72h~144h的产量变化较大。
3由褐黄孢链霉菌发酵过程镜检图可知：种子培养基的镜检菌丝球较少，小菌丝较多。
随着发酵时间增长，发酵液中菌丝球不断增大，菌丝增多，孢子产生。
褐黄孢链霉菌发酵为好氧发酵，在摇瓶发酵过程，菌体会形成菌丝球。
随着菌体生长，菌丝球增大，生长后期，菌体变老，孢子增多。
总结：在实验中，我学到了纳他霉的发酵生产及分离纯化的方法，对好氧微生物的发酵的基本过程有了较深刻的认识，并且对褐黄孢链霉菌在各个发酵过程中其菌体的大体变化趋势有了一定的了解。
另外，在这次实验过程中我的实验操作能力也得到了加强。
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