生物芯片的制造及其应用081114

• 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核 酸变性和复性理论。即双链核酸在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后 又可依碱基配对规律形成双链。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹 杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot hybridization ） 和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。其基本过程包括下列几个步骤。 （1）制备样品：首先从待检测组织提取DNA或RNA。 DNA应先用限制性内切酶消 化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一 般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在 凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支 持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜 上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。 （2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸 片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探针需要被标记上可直接检测 的元素或分子。 （3）杂交：先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位 点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记 好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。 （4）检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要 用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等标记的探针则需要用相 应的免疫组织化学的方法进行检测。
RNA的分类
线粒体 mt tRNA mt mRNA mt tRNA
注：原核细胞不含后3种RNA
细胞核和胞液 核蛋白体RNA 信使RNA 转运RNA 不均一核RNA 小核RNA 小胞浆RNA rRNA mRNA tRNA hnRNA snRNA scRNA/7SL-RNA
功能 核蛋白体组成成分 蛋白质合成模板 转运氨基酸 成熟mRNA的前体 参与hnRNA的剪接、转运 蛋白质内质网定位合成的信 号识别体的组成成分
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• 5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基 因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标 基因的降解，即为转录水平后调控。
• 6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不 参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒 感染。
miRNA Detection and Expression Profiling
What are the differences between miRNA and mRNA • miRNAs are too short to allow the alternative probe sequence selections
• miRNAs do not have polyA tail to initiate cDNA synthesis
• miRNA labeling requires different strategy • miRNAs’ short lengths give more dispersed hybridization affinity and thus signal strength
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PCR用于病毒感染的基因诊断
在优化的条件下， 核酸杂交可检测 到pg水平的靶分 子，约相当于 106个分子。 但是在许多临床 情况下，无法得 到这样的样品量。 用PCR来特异性 地增加靶分子量， 提高敏感性。 组织中总RNA的提取 ↓ 利用反转录酶合成cDNA ↓ PCR反应： 反应液组织：反应缓冲液 模板（上述合成的cDNA） 底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物（例如某种病毒特异性引物） TaqDNA聚合酶 循环：95℃，30sec（变性） ↓ 55℃，1min（退火）30 or more 循环 ↓ 72℃，1min（聚合） 检测：电泳或核酸杂交
Oligonucleotide DNA的半保留复制 (semiconservative replication)
Hybridization
Tm=69.3＋0.41(%G+C)
核酸杂交及其应用示意图 Ⅰ.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链; Ⅱ.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体； 虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡; Ⅲ.粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记。
2. 基因芯片的制备技术
生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成 千上万个与生命相关的信息分子，它可以对生命科学与医学中的各种 生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活 性物质进行高效快捷的测试和分析。 生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概 念，因此具有高效、高信息量等突出优点。 生物芯片的设想最早起始于80年代中期，90年代美国 Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，即将特定序列的 寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上， 作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。 Affymetrix公司生物芯片的市场占有率超过50%。 2002年, Nimblegen公司、 Xeotron开始提供光引发原位合成微点阵 （microarray）芯片。 Xeotron公司，微流体 (microfluidic array)芯片; 2004年，Atantic、LC-Science; 2006年，LC-Bio; 2008年，LC-Genetics。
purine
pyrimidine
adenine
guanine
cytosine
uracil
thymine
DNA的二级结构双螺旋结构 (double helix model)
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(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成 相同； (2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的 年龄、营养状态或者环境变化而改变； (3)几乎所有的DNA，无论种属来源如何， 其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相 同([A]=[T])，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩 尔含量相同([G]=[C])，总的嘌呤摩尔含量 与总的嘧啶摩尔含量相同([A]＋[G]=[C]＋ [T])； (4)不同生物来源的DNA碱基组成不同， 表现在(A＋T)/(G＋C)比值的不同。
基因芯片的制造及其应用
夏咏梅
2008.11.03
1. 基本概念回顾 2. 基因芯片的制备技术 3. 基因芯片的应用
我是不听她上 化学课的，你 们看着办吧！
1. 基本概念回顾 just for chemistry people
• 核酸包括DNA和RNA两大类。 • DNA 核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌 呤(adenine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶 (cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。 DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)； 胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中； 而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。 嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光 有较强的吸收。碱基的这一特性常被用来对碱基、核苷、 核苷酸和核酸进行定性和定量分析。
RNA的结构与功能
DNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常由蛋白质的功能来实现，但DNA并 非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。正常细胞遗传信息的流向 是： 反转录作用(reverse transcription) 与DNA相比，RNA种类繁多，分子量相对较小，一般以单股链存在，但可以有局 部二级结构RNA碱基组成之间无一定的比例关系，且稀有碱基较多。此外，tRNA 还具有明确的三级结构。
From Bartel, D. P. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281–-297 (2004)
PCR
基因诊断的方法
•与疾病相关的遗传背景改变主要有两类，一是遗传物质，即DNA或 RNA的水平变化。二是遗传物质的结构变化，即基因突变，如点突变 引起的基因失活，及染色体转位引起的基因激活或灭活等等。所以理 论上说检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。
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miRNA与siRNA的不同点
• 1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人 工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNAi的中间产物。 • 2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。 • 3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅 是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源 于双链RNA的前体的两侧臂。 • 4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可 作用于mRNA的任何部位。
miRNA和siRNA的基本介绍及区别
• siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。 SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1(RNAi缺陷基因-1)调控完成。只降 解与其序列互补配对的mRNA。 MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长度为22nt左右的5′端带磷酸 基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在 于真核生物中，不具有开放阅读框架，不编码蛋白质，一般长2024nt，miRNA的转录产物是发夹状结构，在RNaseⅢ酶切后以双链形 式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA 5′端的磷酸 基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。 miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组 织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性， 也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。是一类高 度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种 。 人类基因组中大约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的 1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发现小RNA 与‘epigenetic’现 象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的特征性的遗传改 变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制 HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治 疗。
Formation of miRNA
Micro RNA (miRNA) is endogenous and present across species. Primary miRNA transcripts (Pri-miRNAs) are processed by RNase III enzyme, Drosha, to generate ~70 to 100 nucleotides (nt) hairpin precursors (Pre-miRNAs). Pre-miRNAs are then further processed by another RNase III enzyme, Dicer, to yield mature miRNAs, ranging from 17 to 24 nt in length. miRNAs are incorporated into the RNA interference (RNAi) effector complex, RISC, and target specific messenger RNAs (mRNA) for translational repression or mRNA cleavage. Therefore, miRNAs play an important role in regulating gene expression.