土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(整理)
完整版：土壤中分解尿素细菌分离与计数
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30— —300的平板，则说明稀释操作比较成功， 并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数 的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不 精确，需要重新实验。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进 行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
这个实例可以看出，实验结果要有说服力， 对照的设置是必不可少
二、实验设计
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样
“微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70%—90%是细菌
鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生物的生存 1、酚红培养基：
鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→ 培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶 阳性 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红—美蓝结 合→ 菌落呈深紫色并带有金属光泽。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽
从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去 表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的 信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用 前都要灭菌。
（二）制备培养基 制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？ （对照作用）
相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落 数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋 白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起 到了选择作用。
分解尿素的细菌的分离和计数
分解尿素的细菌的分离和计数(答案)(总2页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、基础知识1. 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2，这是因为细菌能合成脲酶。
2．科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
3. 在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。
除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。
4. 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于 1 个活菌。
通过统计菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。
5．统计的菌落数比活菌的实际数目低。
这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数来表示。
6．设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
7．对照实验是指除了被测试条件外，其他条件都相同的实验。
满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。
二、实验设计1. 实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。
2．根据图示2－7填写以下实验流程：3．土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性的潮湿土壤中，约70％～90％为细菌。
4．分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同。
5．培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。
细菌一般在 30～37℃培养1～2d，放线菌一般在 25～28℃培养5～7d，霉菌一般在 25～28℃的温度下培养3～4d。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
5.测定细胞总氮量或总碳量
7
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
8
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中 的菌落数？
答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计 3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁 栏的公式进行计算。
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
富集一些。
检测：酚酞的灵敏度不
如酚红，因此建
议最好使用酚红，
否则效果不明显。
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
培养基 类型
日期 第一天 第二天
平板细菌数（土壤稀释度）
选择性培养基
（涂布接种）
（未涂布接种）
牛肉膏蛋白胨 培养基
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀课件
本课题知识小结:
33
12
两稀释度 菌数之比
1.6 2.2
-
菌落总数 个/g或个/ml
16400 38000 27100 513000
270 30500
报告方式 个/g或个/ml 16000或1.6×104 38000或3.3×104 27000或2.7×104 510000或5.1×105 270或2.7×102 31000或3.1×104
102
103
104
105
106
107
101
10g土壤
9ml
无菌水
9ml 无菌水
104
105
106
107
104
105
106
107
104
105
106
107
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验方案尿素是一种含氮有机化合物，广泛用作化肥和动物饲料。
土壤中的细菌可以通过分解尿素来获取氮元素，从而促进土壤微生物群落的生长和发展。
为了研究土壤中分解尿素的微生物群落，可以进行以下实验：
1.采集土壤样品，将其通过蒸馏水过滤器过滤，以去除大颗粒物和悬浮物。
2.将过滤后的土壤样品接种到含有尿素的培养基中，利用不同的培养条件(如温度、pH值、氧气含量等)筛选出适宜于生长的细菌。
3.将筛选出的细菌进行单一克隆培养，然后通过染色、显微镜观察和生化测试等方法对其进行鉴定和分类。
4.最后，可以利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验步骤：
1.收集土壤样品，通过蒸馏水过滤器过滤。
2.制备含尿素的培养基，分别设置不同的培养条件，如温度、pH 值、氧气含量等。
3.将过滤后的土壤样品接种到培养基中，进行培养。
4.观察培养基中是否有细菌生长，记录细菌的数量和形态特征。
5.对生长的细菌进行单一克隆培养，然后进行鉴定和分类。
6.利用计数板等设备对土壤中分解尿素的细菌进行计数。
实验注意事项：
1.在实验过程中要注意卫生，避免污染。
2.制备培养基时要严格按照配方和操作步骤进行。
3.培养时要控制好温度、pH值、氧气含量等条件，以便筛选出适宜于生长的细菌。
4.鉴定和分类时要准确和细致，避免误判。
5.计数时要进行多次重复，以提高结果的精度和可靠性。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3.重复组的结果是否一致
如果各位同学选取的是同一种土样，统计的结 果应该接近。如果结果相差太远，则需要从各项操 作过程中去分析、寻找可能的原因。
六、课 题 延 伸
能分解尿素的细菌的鉴定
鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基
的pH升高。 鉴定方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指 示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基 的颜色变化。
三、设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。Leabharlann 2.样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在 30～300的平板，则说明稀释操作比较成 功，并能够进行菌落的计数。
碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选 作用？如果有，又是如何进行筛选的？
有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合 成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。
二、 统计菌落数目
原理
运用稀释涂布平板法来统计样品中的活 菌数。
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释 度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源 于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释 度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果 准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板 上，培养后再选择菌落数在30 ～300的平板进行 计数。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(4)计数：当菌落数目稳定时，取同一 稀释度 下的3个平 板进行计数，求出 平均值 ，并根据所对应的 稀释度计算出 样品中细菌的数目
2．菌种鉴定 (1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨， 使培养基的碱性 增强。 (2)方法：在以 尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示 剂培养细菌，若指示剂变 红 ，可确定该种细菌能够分解尿
圆褐固氮菌生活于土壤中，能以氮气作为氮源。请探 讨、交流实验室分离圆褐固氮菌的方法。
提示：配制无氮培养基作为选择培养基。
[跟随名师·解疑难] 1．选择培养基的类型及作用 (1)在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以 分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡 萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上 加入。 (2)改变培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源时， 可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基 上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也 具有分离效果。 (3)改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境 中培养只能得到耐高温的微生物。
[自读教材·夯基础]
1．实验设计流程
1土壤①土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿
取样
②取样部位：距地表约3～8
cm的土壤层
①稀释原因：样品的稀释程度直接影响
平板上生长的菌落数目
2样品稀释②稀释标准：选用一定稀释范围的样品
液进行培养，保证获得菌落数在 30～300 之间便于计数
①培养：不同种类的微生物，往往需要 3培养与观察不②同观的察培：养每温隔度24和h统培计养一时次间菌落数
1.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平 板法和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目， 但统计结果往往比活菌数目低。
实验03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理：（1）土壤中的细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成尿酶。
（2）配置以尿素为唯一氮源的培养基，能够在这个培养基上生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
二、操作步骤：(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。
(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。
②观察a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。
2、灭菌培养基：高压蒸汽灭菌法3、培养皿灭菌：干热灭菌法三、操作提示(1)无菌操作①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在酒精灯火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。
例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需注意的问题(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。
(3)为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组，目的是排除实验中偶然因素对实验结果的影响。
(4)分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
(5)为防止培养时间不足导致菌落遗漏，在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定
分离与计数
2021/4/21
1
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被 农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后 才能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)
2021/4/21
+ H2O
脲酶
2
2021/4/21
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实践训练
A
1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）
A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌
2C..使接用种选一择个培细养菌基的D目.及的时是补（充消C）耗的营养物质
A.培养细菌
B.培养真菌
C.使需要的微生物大量繁殖
D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别
3A.能.CDO合2和成N脲2 酶的微B生.葡物萄所糖需和要N的H3碳源和氮源分别是( )
5、培养基选择分解尿素的微生物的原理
培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微 生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏 脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源 而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用 此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
2021/4/21
8
6、怎样证明此培养基具有选择性呢？
培养基类型
2021/4/21
6
3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培 养基：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O
葡萄糖
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
基础知பைடு நூலகம்：
（一）筛选菌株
KH2PO4
1.4g
NaH2PO4
2.1g
MgSO4`7H2O 葡萄糖
0.2g 10.0g
尿素 琼脂
选择培养基
1.0g 15.0g
培养基配方
思 考：该培养基对微生物具有选择作用吗？如果 具有，是如何进行选择的？
只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种
• 2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生 物，其中也包括分解尿素的微生物。由于 瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后 会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生 物除了需要准备选择培养基外，还应参照 厌氧菌的培养方法进行实验设计。
分析P22实例:
你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认 为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如 何改进？
第一位同学没有重复实验(至少涂布3个平板)，结 果不具有说服力。
第二位同学有重复实验，但结果不一致（误差较 大），说明在操作过程中可能出现错误，需要重 新实验。
【例1】为了计数微生物的数量，一位同学在4
1、酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增
强，PH升高→酚红指示剂，变红 2、伊红—美蓝培养基： 鉴定大肠杆菌。 原理：代谢产物与伊红-美蓝结合→菌落呈黑
色。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征
大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽
本课题知识小结:
课后练习
——利用血球计数板在显微镜下直接计数。
（2）活菌计数法——统计菌落数目
方法： 稀释涂布平板法。 原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长 的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
专题2 微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数课题背景尿素是一种重要的农业氮肥。
但是，尿素不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的细菌将尿素分解成之后，才能被植物吸收。
细菌为什么能分解尿素？怎样分解的？（写出化学反应式）一、基础知识（一）筛选菌株1、实验室微生物的筛选原理是什么？2、培养基（1）分析右边的培养基配方，回答：○1在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？○2分析该培养基的配方，想一想这种培养基对微生物是否有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？（2）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基，称作。
（二）统计菌落数目测定微生物数目的常用方法：、1、显微镜直接计数法：（1）原理?利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
（2）显微镜直接计数法的缺点是什么？2、稀释涂布平板法（活菌计数法）（1）为什么通过测平板上的菌落数可以推测样品中的活菌数？（2）如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数？【例题】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）（）A. 2.34X108B. 2.34X109C. 234D.23.4（3）统计的菌落数往往比活菌的实际数目高还是低？为什么？特别注意：统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
【实例分析1】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。
在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板。
统计的菌落数分别为21、212和256.该网学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果你认为哪位同学的结果接近真实值?你认为这两位同学的实验需要改进吗?如果需要，如何改进?【实例分析2】在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。
课题2 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
导入新课上一节课我们已经学习了培养基的配制以及接种技术，现在我们就来学习如何从土壤中将我们需要的微生物进行分离。
土壤微生物尿素是由碳、氮、氧和氢组成的有机化合物。
外观是白色晶体或粉末。
尿素化学式尿素尿素通常作为一种植物的氮肥，广泛应用于各种作物和土壤。
但是，农作物不能直接吸收尿素，必须先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和二氧化碳，才能被植物利用。
脲酶CO(NH2)2+H2O → 2NH3+CO2这种细菌能够分解尿素，是因为他们能够合成脲酶。
脲酶脲酶是一种蛋白质，能溶于水，不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂。
加热和重金属离子都能抑制或降低脲酶的活性。
想一想你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来吗？专题2 微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、研究思路二、实验设计三、操作提示四、结果分析与评价五、课题延伸教学目标知识与能力研究培养基对微生物的选择作用。
过程与方法从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；统计每克土壤样品中含有多少这样的细菌。
情感态度与价值观从感性上认识分离尿素的细菌，了解其具有的作用。
重点与难点1. 课题重点对土样的选取和选择培养基的配制。
2. 课题难点对分解尿素的细菌的计数。
（一）筛选菌株耐热微生物温泉耐寒微生物冰川分解石油的细菌油田筛选原则：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
实例：Taq DNA聚合酶的发现DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术。
此项技术的自动化，要求使用耐高温的DNA聚合酶，该去哪里寻找？科学家是从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的Taq DNA聚合酶的。
为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？这是因为热泉70~80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌脱颖而出。
实验室中微生物的筛选，也应用了同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（一）筛选菌株
3、选择培养基
根据微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不
同，配制的允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他
种类微生物生长的培养基。
本课题使用的选择培养基
物理特性：固体培养基 功能特性：选择培养基
例：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应 稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
(D )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和261，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平 均值163
【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每 毫升样品中菌落数就为234/0.1×106=2.34×109。
（二）统计菌落数目
2.间接计数法→活菌计数法
（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一 个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
（2）常用Байду номын сангаас法：稀释涂布平板法。
葡萄糖
10.0g
不缺能乏分氮解源尿的素培，养缺基乏—氮—源分而离不固能氮生微长生物
尿素 琼脂
1.0g 15.0g
发在育无繁氧殖条，件而下受的到普抑通制培，养所基以—用—此分培离厌氧型将和上兼述性物质厌溶氧解型后微，用生蒸物馏水
养基就能够选择出分解尿素的微生物。
定容到1000mL。
例：下列能筛选出分解尿素的细菌的培养基是( A )
但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没 有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同 学排除上述两个可能影响因素吗？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、教学目标：1.能按照科学探究的要求，应用稀释涂布平板法和微生物数量测定的方法，设计从土壤中分离分解尿素的细菌并进行计数的方案。
2.依据设计的方案，运用无菌操作技术和微生物分离、培养的方法初步分离出目标菌。
3.尝试解决生产、生活中与微生物选择培养、计数等有关的实际问题。
二、教学重难点：教学重点：实验设计方案的设计与修正，正确进行实验操作教学难点：设计实验方案。
三、教学过程：提出问题（实验目的）：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
基础知识（实验原理）：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
选择培养基配方： 组分 含量KH 2PO 41.4g Na 2HPO 42.1gMgSO 4·7H 2O0.2g葡萄糖10.0g 尿素1.0g 琼脂 15.0gH 2O定容至1000mL 实验设计：请同学们阅读教材19页资料，思考有关问题，小组合作进行实验设计，写出详细的实验方案，交流修正。
实验步骤：按照方案，选择合适的实验材料，进行实验。
(一）、土壤取样细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm 的土壤层。
因此，取样时一般要铲去表层土。
将样品装入纸袋。
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。
操作完成后，一定要洗手。
(二）、制备培养基用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组，用来判断选择培养基是否具有选择作用。
(三）、样品的稀释与涂布平板（稀释涂布平板法）简要回顾操作梯度稀释：在酒精灯火焰旁称取10g土壤，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。
用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。
人教版高中生物选修一专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学案含解析
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、研究思路1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2．统计菌落数目(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C ÷V )×M 。
C ：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V ：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M ：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
.1.实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。
稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。
4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，依据是否变红进行判断。
(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
3．设置对照(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计1．土壤取样从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。
土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
尿素分解细菌的纯培养
尿素分解细菌的纯培养是分离尿素分解细菌的关键步骤， 通过选择性培养基，将土壤中的尿素分解细菌分离出来， 获得单一菌落。
培养基中添加尿素作为唯一氮源，以筛选出能够分解尿素 的细菌。同时，培养基中还应添加适量的其他营养成分， 以满足尿素分解细菌的生长需求。
尿素分解细菌的计数方法
尿素分解细菌的计数可以采用菌落计数法或细胞计数法。菌落计数法是通过培养 基上形成的菌落数量来计算尿素分解细菌的数量，而细胞计数法则采用显微镜直 接观察和计数细胞。
菌落计数法操作简便，但可能存在菌落重叠和无法区分死菌和活菌的问题。细胞 计数法虽然准确度高，但操作较为复杂，需要使用显微镜和专业的细胞计数器。
尿素分解细菌的计数实验步骤
将土壤样品稀释后涂布在含有尿素的 培养基上，然后进行培养。
对筛选出的尿素分解细菌进行纯培养， 并进行进一步的生理生化实验和分子 生物学鉴定，以确定其种类和特性。
采集时间
采样方法
选择适宜的时间采集土壤样品，通常 在春季或秋季进行，此时土壤中的微 生物活性较高。
采用多点采样法，在不同地点和深度 采集土壤样品，以获得更全面的土壤 信息。
采样地点
选择具有代表性的土壤区域进行采样， 如农田、森林、草地等，确保采集的 土壤样品具有广泛性和代表性。
分离尿素分解细菌的方法
生长特性
这些细菌在尿素培养基上 生长良好，表现出对尿素 的良好分解能力。
尿素分解细菌的记数结果
菌落计数
通过菌落计数法，对分离 出的尿素分解细菌进行数 量统计。
数量分布
在土壤的不同区域，尿素 分解细菌的数量分布存在 差异。
生长条件
部分尿素分解细菌对生长 条件较为敏感，如温度、 pH值等。
_高中生物专题2微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数三作业含解析新人教版选修
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1．耐冷菌是生活在低温环境下的一类微生物，在0～5 ℃可生长繁殖，最高生长温度一般在30 ℃左右。
下列关于耐冷菌的说法不正确的是（）A．耐冷菌参与代谢的酶在低温下仍具有较高的催化活性B．不同取样地点相比较，北方寒冷地区水土中较易分离出耐冷菌C．探究耐冷菌生活的最适温度，自变量应为温度，无关变量应相同且适宜D．分离纯化耐冷菌的过程中，使用过的培养基及培养物必须经过消毒处理后才能丢弃2．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是（）A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基3．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。
原因是（）A．平板上的一个菌落就是一个细菌B．菌落中的细菌数是固定的C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同4．在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。
A同学的结果产生原因不可能有（）A．土样不同B．培养基污染C．操作失误D．没有设置对照5．统计菌落数目的方法有（）①涂布平板法②重量法③直接计数法④比浊法⑤生理指标法⑥膜过滤法A．①②③⑥B．③④⑤⑥C．① D．①③6．用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。
在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌株数真实值的是（）A．菌落数量最多的平板 B．菌落数量最少的平板C．菌落数量适中的平板 D．取若干个平板菌落数量的平均值7．下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是（）A．利用稀释涂布平板法只能分离微生物，不能对微生物进行计数B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落C．以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌D．用大白菜腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量的变化是先增加后减少8．关于微生物的培养，下列叙述错误的是（）A．霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 dB．不同种类的微生物，一般培养的温度和时间不同C．测定真菌数量，一般选用103、104、105倍稀释D．微生物培养要注意无菌操作9．下列有关微生物培养与应用的说法，正确的是（）A．天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理C．大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段D．分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源10．本课题以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是（）①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②从土壤中分离出能够分解氨的细菌③统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌④统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌A．①③ B．②④C．①② D．③④11．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（）A．加尿素、加琼脂、不加葡萄糖、加硝酸盐B．不加尿素、加琼脂、加葡萄糖、加硝酸盐C．加尿素、加琼脂、加葡萄糖、不加硝酸盐D．不加尿素、不加琼脂、加葡萄糖、加硝酸盐12．从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。
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例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内 斗争最显著最激烈的时期是 答案：C A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物 对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时 候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加， 每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体 对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。 由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数 目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产 物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环 境的斗争。
㈢.设置对照：
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素 对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数 目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基 中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样 的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。 原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质)
思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀 释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分 解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 是不同的。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不 同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地 提供选择培养的条件。
原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）
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另 2 个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，
因此，不能简单地将 3 个平板的计数值用来求平均值。 这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至
少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服 力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置
的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有 误，需要重新实验。
（一）筛选菌株
水生耐热细菌Taq
启示?
耐高温的Taq DNA聚合酶
选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生
物生长，同时抑制或阻止其他种类微生 物生长的培养基。
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思考：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g
课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数
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复习提问
1.培养基的概念和种类？ 2.固体培养基和液体培养基的区别？固体 培养基在实验室的作用？ 3.培养基的成分和特殊要求有哪些？举例 说明？ 4.避免杂菌污染包括哪4个方面？ 5.什么是消毒、灭菌？常见的消毒和灭菌 方法有哪些？
复习提问
所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一 个菌落代表原先的一个单细胞。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代 表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少 3个
㈣.取样涂布
◆实验时要 对培养皿作 好标记。注 明培养基类 型、培养时 间、稀释度、 培养物等。
◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如 果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试 验不精确，需要重新实验。
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㈤.微生物的培养与观察
用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设 置的对照是( ) C A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D．接种了的选择培养基
选C。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培 养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的 数目，因此，应选牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。 对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一 样接种、培养。
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3.使用选择培养基的目的是（ ） C A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 4.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 ( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 D C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
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①从物理性质看此培养基属于哪类？
固体培养基
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②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
3、培养基选择分解尿素的微生物的原理？ 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物 才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发 育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选 择出分解尿素的微生物。
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测定土壤中细菌数量一般选用104、105和 106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌 的数量一般选用102、103和104倍稀释， 其原因是( ) C A．细菌个体小，真菌个体大 B．细菌易稀释，真菌不易稀释 C．细菌在土壤中数量比真菌多 D．随机的，没有原因
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6.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中 加入（ C ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐 点此播放教学视频
C
利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸 奶的常用菌种分别是（ ） A．酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌 B．酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌 C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳 酸菌 D．黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌
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分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是 ( ) ①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不 加硝酸盐 A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时， 一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有 误，需要重新实验。
说明设置重复组的重要性。
思考书 本22页 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此 问题：
结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问 题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与
五.课外延伸
1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH 升高，指示剂将变红，说明该细菌能够 分解尿素。
脲酶
五.课外延伸
2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌 过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠 杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30— —300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三 个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出 菌落平均数。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
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直接计数法、 活菌平板计数法、
比浊法（原理是在一定范围内，菌的 计数法
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
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3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏 杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些 真菌和放线菌也能分解尿素。
3、课题目的
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
一.研究思路
㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照
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是
生长多种 微生物
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定 容积里样品中微生物的数量。
缺点：
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
2.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上
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二.实验的具体操作
㈠.土壤取样 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
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[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于 计数的平板 点此播放教学视频
1、土壤取样 2、制备培养基： 3、样品的稀释 4、取样涂布 5、微生物的培养与观察
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微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
对照的培养皿在培养中无菌落 1 、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染 生长，说明培养基没有被杂菌 以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 污染。 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数 2 、 是否获 得 了某 一 稀释 度 下 ， 菌 落数 目在 目明显大于选择培养基，说明 30——300 的平板。在这稀释度下，是否至少 选择培养基具有选择作用。 有两个平板的菌落数相近？ 3 、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细 菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？ 如果差异很大，可能是什么原因引起的？
悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光 密度成正比，菌越多，光密度越大。因此 可以借助于分光光度计，在一定波长下， 测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌 量。）
膜过滤法（当样品中菌数很低时，可
以将一定体积的湖水海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色， 并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜 上 ( 或一定面积中 ) 的细菌数 ）