流式细胞术分析及应用PPT课件
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流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
流式细胞术原理及应用通用课件
抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术简介及应用进展ppt课件
CBA反响微球探针复合体构造方式 图
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
;
Thanks for your attention!
;
;
三、流式细胞术运用的新进展
;
高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
;
BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
;
Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
;
BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
;
1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
;
2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
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Thanks for your attention!
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三、流式细胞术运用的新进展
;
高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
;
BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
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Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
;
BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
;
1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
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2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展
流式细胞术及其科研应用课件
03
标准化和规范化
为了更好地发挥流式细胞术在科研和临床实践中的作用，需要进一步推
动技术的标准化和规范化，建立统一的实验操作规范和技术标准，提高
实验结果的互通性和可比性。
THANKS
感谢观看
流式细胞术的发展趋势与展望
01 02
技术创新与发展
随着科学技术的发展，流式细胞术将不断进行技术创新和改进，如采用 更高分辨率的检测系统、开发多维数据分析方法等，提高实验结果的准 确性和可靠性。
拓展应用领域
随着科研领域的不断拓展，流式细胞术将进一步应用于生命科学、医学 、环境科学等多个领域，为解决复杂问题提供更多有力的工具。
通过计算机对电信号进行处理和分析 ，可以获得细胞的多种特性，如大小 、内部抗原表达等。
02
流式细胞术的技术特点
流式细胞术的速度与精度
速度
流式细胞术可以同时处理多个样本，每秒钟可以分析数十万个细胞，使得研究 人员能够快速获得大量数据。
精度
流式细胞术具有高分辨率和高灵敏度，能够准确地检测细胞表面的抗原、细胞 内的抗原以及细胞活性等。
流式细胞术及其科研 应用课件
contents
目录
• 流式细胞术概述 • 流式细胞术的技术特点 • 流式细胞术在科研中的应用 • 流式细胞术的未来发展与挑战 • 总结与展望
01
流式细胞术概述
流式细胞术的定义
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在 液流中快速检测细胞特性的技 术。
详细描述
流式细胞术能够通过对淋巴细胞、树突状细胞、NK细胞等免疫细胞的检测，揭示免疫细胞的发育、分化、激活 和功能，为研究免疫应答的调控机制提供了重要的手段。同时，流式细胞术还可以用于研究疫苗接种后的免疫反 应、病原感染后的免疫应答等，为疫苗研发和疾病治疗提供了重要的参考。
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
流式细胞术应用概述分析解析ppt课件
抑制免疫反应/杀伤异源细胞
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
-
12
第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
-
13
1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
-
14
原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
-
16
淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
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12
第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
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13
1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
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14
原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
-
16
淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫
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授课：XXX
23
CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）
授课：XXX
24
4.细胞凋亡的检测
授课：XXX
25
Annexin V Assay
授课：XXX
28
Annexin V/PI双染
活细胞为（Annexin V-/PI-） 坏死细胞为（Annexin V+/PI+） 凋亡细胞（Annexin V+/PI-）
Shades of a color
授课：XXX
33
Example 6-bead assay
IL-8 IL-1b
IL-6 IL-10 TNF
Detec flow cytometer
IL-12
Lysate or Supernatant
Capture Beads
入射激光90角的散射光信号 细胞粒度及细胞内相对复杂性。
授课：XXX
11
前向角散射光 ——FSC
Laser
FALS Sensor
授课：XXX
12
侧向角散射光——SSC
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
授课：XXX
13
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形 态上的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的 数据
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
授课：XXX
8
流式细胞仪的光学系统
激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一 方向、同步的稳定光照。
激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波 长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9， 568.3， 633，647 nm
授课：XXX
29
Annexin V Assay----能够区分死亡与凋亡
授课：XXX
30
5、细胞因子测定
Capture antibody Beads
Capture beads
+
+
Antigen (cytokines) Fluorescence Detector
antibody
授课：XXX
31
Beads Provide a Flexible Platform
12 mL/min
Optical Cuvette
Laminar Flow
High Sample Flow Rate
60 mL/min
Laminar Flow
2021/3/9
Sheath
Sheath
Sample
授课：XXX
Sheath
Sheath
Sample
6
样品和鞘液流
授课：XXX
7
Injector Tip
授课：XXX
3
现代流式细胞仪包括
液流系统
聚焦细胞以供检测
光学系统
激发和收集光信号
电子系统
将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计 算机分析
授课：XXX
4
液流系统
液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
授课：XXX
5
Sample Flow in Optical Cuvette
Low Sample Flow Rate
Sample
授课：XXX
34
CBA Standard curves
授课：XXX
35
6、细胞分选
488 nm laser
- Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
授课：XXX
授课：XXX
17
Compensation
授课：XXX
18
二、流式细胞术的应用
细胞表型分析 胞内蛋白的检测 细胞周期分析 细胞因子测定 分选 细胞内钙离子测量 ……
授课：XXX
19
1.细胞表型分析
CD4
CD3
授课：XXX
20
2.胞内蛋白的检测
授课：XXX
21
授课：XXX
22
3. 细胞周期的检测
流式细胞术分析及应用
授课：XXX
1
主要内容
流式细胞术的原理 流式细胞术的应用 流式细胞术的数据处理 流式细胞术的样品制备
授课：XXX
2
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算 机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动 的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000 个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
36
授课：XXX
37
细胞分选
授课：XXX
38
三、流式细胞数的数据处理
授课：XXX
39
授课：XXX
40
授课：XXX
41
授课：XXX
42
授课：XXX
授课：XXX
14
散点图——Dot Plot
lysed 授w课h：oXleXXblood
15
2. 荧光信号
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
授课：XXX
16
Fluorochrome specification
光收集系统是由若干组透镜，滤波片，小孔组成，将产 生的光信号引导至检测器。
授课：XXX
9
流式细胞仪的光信号
散射光信号 荧光信号
授课：XXX
10
1. 散射光信号
•前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
入射激光的同向散射光信号 细胞相对大小及其表面积。
•侧向角散射（SSC, Side Scatter）
Beads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer
Multiple sizes
Different intensities
授课：XXX
Different colors with
different intensities
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Multiplexed Beads
Various analytes
Antibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensities
Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.