利用微生物转化维生素D3的研究25-OH-D3的生物转化
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[ 1~ 3]
维生素 D3 的技术 , 我们进行了活性菌株的筛选、 将 维生素 D3 转化成为活性维生素 D3 25( OH) D3 和检测活性维生素 D3 研究结果简报如下. 25( OH) D3 的试验, 现将
. 目前由
于有机合成活性维生素 D3 的技术要求高、 程序复 杂且耗资巨大, 故而无法在临床上广泛使用活性维 生素 D3 [ 4] . 有些放线菌具有把维生素 D3 转化成为 活性维生素 D3 进展较快
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2. 1
结果与讨论
结 果 25( OH) D3 . 试验结果
在上述试验条件下, TN - 955 菌株可以将维生素 D3 转化为活性维生素 D3 见图 2、 图 3 和表 1.
图 2 25( OH) D3 标样和转化物的维生素类似物的薄层层析
生物转化物中的 25( OH) D3 ; 25( OH) D3 的标样 ; 生物转化物中的 25( OH) D3 ; 生物转化物中的 25( OH) D3 + 标样 25( OH) D3
[ 5~ 10]
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材料和方法
供试菌种和筛选方法 供试菌种: 放线菌菌株 TN - 955. 土壤样品: 从天津、 北京、 辽宁等地营养极缺乏
25( OH) D3 的功能 , 相关学科的 . 为了开发出 利用微生物生产 活性
收稿日期 : 2002- 06- 09 基金项目 : 天津市农业生物中心攻关项目 ( 00322111- 3) 作者简介 : 郑东虎 , 男 , 1954 年生 , 吉林集安人 , 副教授 , 博士 , 主要从事食用菌和生物制药方面的研究 .
Fra Baidu bibliotek
Fig . 3 HPLC analysis of the sample and the product of 25( OH) D3
第 20 卷第 2 期 200 4年3月
科技通报
BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Vol. 20 No. 2 M ar. 2004
利用微生物转化维生素 D3 的研究 ( 25( OH) D3 的生物转化
郑东虎1 , 邢克智2 , 朴顺兰3 , 韦东胜1, 张远方4 , 桂
)
ZHENG Dong -hu , XING Ke-zhi , PIAO Shun -lan , WEI Dong -sheng , Z HANG Yuan -f ang , GUI Zhi
( 1. Department of Agronomy, Tianjin Agri cultural College, Tianjin 300384, China; 2. Department of Fishery Science, Tianjin Agricultural Coll ege, Tianjin 300384, China; 3. Department of Agricultural Engineering, Tianjin Agricultural College, Tianj in 300384, China; 4. Tianjin Agricultural Demonst ration Center, Tianjin 300384, China)
从图 2 可以看出, 培养基和微生物代谢产物的 斑点中 有明显的 生物转 化物 25( OH) D3 的 斑 点, 其它成分尚需一一进行分析. 从高效液相色谱分析结果 ( 图 3 和表 1) 中可以 看出 , 培养基和微生物的代谢产物中有明显的生物
第 2期
郑东虎等 . 利用微生物转化维生素 D3 的研究 (
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科
技
通
报
第 20 卷
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薄层层析分析 在高效薄层层析板上用已筛选出的推动剂对
提取液进行薄层层析 . 1. 6 高效液相色谱分析 分析条件 : 采用甲醇为流动相, 蒸馏水 ( 9 1) ,
柱温是 50 ; 波长是 256 nm, 色谱柱是 ZORBAXC RPSM - 300( 10 m) ; L 为 250 mm; D 为 4. 6 mm; 流速 是 1. 0 mL/ min. 标样的试剂由德国默克公司有偿提 供. 将在高效薄层层析板上分离出的斑点部分刮
( 1. 天津农学院农学系 , 天津 300384; 2. 天津农学院水产系 , 天津 300384; 3. 天津农学院农工系 , 天津 300384; 4. 天津市农业科学院 示范区, 天津 300384)
)
枝1
摘 D3
要 : 根据目标菌株的生物学特征等筛选出若干菌株 , 还成功地利用入选菌株将 维生素 D3 转化成为活 性维生素 25( OH) D3, 并采用已建立的薄层 层析 和高效 液相 色谱等 检测 方法 对入选 菌株 的活性 进行 了鉴定 . 结 果表 25( OH) D3 的功能 .
)
25( OH) D3 的生物转化
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图 3 25( OH) D3 标样和转化物的 25( OH) D3 高速液相色谱分析情况
( a) 25( OH) D3 的标样 ( a) the sample of 25( OH) D 3 ( b) 转化物中的 25( OH) D3 ( b) the product of 25( OH) D3 [ 1] Koyama T, Shibakura M, Ohsawa M, et al . Anticoagulant Effect s of 1alpha , 25 -Dihydroxyvit amin D3 on Human Myelogenous Leukemia Cells and Monocytes[ J] . Blood, 1998, 92: 160- 167. [ 2] POLLY P, HERDICK M, MOEHREN U , et al . VDR -Alien: a novel, DNA - selective vitamin D3 receptor - corepressor partnership [ J] . FASEB, 2000, 14: 1455- 1463. [ 3] Bury Y , Ruf D, Hansen C M, et al . Molecular Evaluation of V it a min D3 Receptor Agonists Designed for Topical Treatment of Skin Diseases [ J] . Invest Dermat ol, 2001, 116: 785- 792. [ 4] O Kelly J, Hisat ake J, Hisat ake Y, et al . Normal myelopoiesis but abnormal T lymphocyt e responses in vitamin D receptor knockout mice [ J] . Clin Invest , 2002, 109: 1091- 1099. [ 5] Cross T. The actinomycet es[ M ] . 1994, Pp. 605 -623. In Holt J. G. , N. R. K rieg, P. H. A . Sneat h, J. T. St aley and S. T. Williams ( ed. ) , Bergey s M anual of Dwterminat ive Bact eriology. 9th, Williams & Wilkins, Balt immore.
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Abstract: According to the biology characteristics of target fungoid, some actinomyces were screened. Only the target actinomyces could translate VD3 into active VD3 25( OH) D3. And then HPLC and TLC were used to detect the activities of the actino myces. All of the results showed that actinomyces TN - 955 had the excellent translation function. Key words: microbiology ; actinomyces; active VD3 25( OH) D3; transformation; detection
明 : 放线菌菌株 TN - 955 具有把维生素 D3 转化成为活性维生素 D3 关键词 : 微生物学 ; 放线菌 ; 活性维生素 D3; 转化 ; 检测 中图分类号 : Q939. 97 文献标识码 : A
文章编号 : 1001- 7119( 2004) 02- 0109- 03
Research on the Active VitaminD3's transformation by microorganism ( 25( OH) D3's Biology Translation
图 1 活性维生素 D3 25( OH) D3 的结构 Fig. 1 The structure of active vitamin D3 25( OH) D3
出, 再次溶解、 离心 后, 用高 速液相 色谱仪进 行分 析.
的土壤中采集了 15 cm 以下的土壤作为供试样品, 进行分离 . 培养基配方 : 葡萄糖 10. 0 g 、 酵母膏 1. 0 g 、 细菌 用蛋白胨 2. 0 g 、 牛肉膏 1. 0 g 、 琼脂 18. 0 g 、 维生素 B 1 0. 5 mg 、 维生素 B2 0. 5 mg 、 烟碱酸 0. 5 mg 、 维生素 B 6 0. 5 mg 、 肌醇 0. 5 mg 、 泛酸盐 0. 5 mg 、 维生素 Bx 0. 5 mg、 维生素 H 0. 25 mg 、 蒸馏水 1000 mL 等, 并将 培养基的 pH 调节在 7. 0~ 7. 2 之间 . 筛选方法 : 在 28 的条件下培养 2 个月, 每隔 30 d 左右就对基质上菌丝的有无、 孢子数及形态、 孢子囊的有无及形态等进行观察, 从中筛选出可能 的放线菌菌株. 将一个能把维生素 D3 转化为活性 维生素 D3 25( OH) D3 的菌株视为活性放线菌菌 株, 并暂命名为 TN - 955. 1. 2 液体培养基 液体培养基 的主 要成 分为 淀粉 1% 、 麦芽 糖 1% . 把 TN -955 菌株的固体菌种接种在液体培养基 上, 在适当的条件下震荡培养 72 h. 把 2% 的液体菌 种接种在 50 mL 液体培养基中, 在同样的条件下震 荡培养 48 h, 之后再加入适量的底物继续震荡培养 48 h. 1. 3 底 物
底物为浓度大于 97% 的维生素 D3 , 由德国默 克公司提供. 1. 4 提 取 在培养的产物中加入等量提取液后 , 混合 , 分 液, 并将下层部分进行真空干燥. 已干燥的物质用 适当的溶剂溶解后, 在 - 21 下放置 30 min, 吸取 上层部分进行高效薄层层析. 分离出的斑点溶解后 用高速液相色谱进行分析 .
Fig. 2 TLC analysis of the sample and the product of 25(OH) D3
the the the the biology product of 25( OH) D3 ; sample of 25( OH) D3 biology product of 25( OH) D3 ; biology product of 25( OH) D3 + the sample of 25( OH) D3
大量研究表明, 维生素 D3 在人体内具有调节 Ca 和 P 代谢的功能 , 其中又以活性维生素 D3 的生 理作用最强 . 虽然, 活性维生素 D3 有 1 ( OH) D3 、 25 ( OH) D3 ( 结构见图 1) 和 1 , 25( OH) D3 等 3 种形式, 但以 1 , 25( OH ) 2D3 的生理作用 最佳
维生素 D3 的技术 , 我们进行了活性菌株的筛选、 将 维生素 D3 转化成为活性维生素 D3 25( OH) D3 和检测活性维生素 D3 研究结果简报如下. 25( OH) D3 的试验, 现将
. 目前由
于有机合成活性维生素 D3 的技术要求高、 程序复 杂且耗资巨大, 故而无法在临床上广泛使用活性维 生素 D3 [ 4] . 有些放线菌具有把维生素 D3 转化成为 活性维生素 D3 进展较快
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结果与讨论
结 果 25( OH) D3 . 试验结果
在上述试验条件下, TN - 955 菌株可以将维生素 D3 转化为活性维生素 D3 见图 2、 图 3 和表 1.
图 2 25( OH) D3 标样和转化物的维生素类似物的薄层层析
生物转化物中的 25( OH) D3 ; 25( OH) D3 的标样 ; 生物转化物中的 25( OH) D3 ; 生物转化物中的 25( OH) D3 + 标样 25( OH) D3
[ 5~ 10]
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材料和方法
供试菌种和筛选方法 供试菌种: 放线菌菌株 TN - 955. 土壤样品: 从天津、 北京、 辽宁等地营养极缺乏
25( OH) D3 的功能 , 相关学科的 . 为了开发出 利用微生物生产 活性
收稿日期 : 2002- 06- 09 基金项目 : 天津市农业生物中心攻关项目 ( 00322111- 3) 作者简介 : 郑东虎 , 男 , 1954 年生 , 吉林集安人 , 副教授 , 博士 , 主要从事食用菌和生物制药方面的研究 .
Fra Baidu bibliotek
Fig . 3 HPLC analysis of the sample and the product of 25( OH) D3
第 20 卷第 2 期 200 4年3月
科技通报
BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Vol. 20 No. 2 M ar. 2004
利用微生物转化维生素 D3 的研究 ( 25( OH) D3 的生物转化
郑东虎1 , 邢克智2 , 朴顺兰3 , 韦东胜1, 张远方4 , 桂
)
ZHENG Dong -hu , XING Ke-zhi , PIAO Shun -lan , WEI Dong -sheng , Z HANG Yuan -f ang , GUI Zhi
( 1. Department of Agronomy, Tianjin Agri cultural College, Tianjin 300384, China; 2. Department of Fishery Science, Tianjin Agricultural Coll ege, Tianjin 300384, China; 3. Department of Agricultural Engineering, Tianjin Agricultural College, Tianj in 300384, China; 4. Tianjin Agricultural Demonst ration Center, Tianjin 300384, China)
从图 2 可以看出, 培养基和微生物代谢产物的 斑点中 有明显的 生物转 化物 25( OH) D3 的 斑 点, 其它成分尚需一一进行分析. 从高效液相色谱分析结果 ( 图 3 和表 1) 中可以 看出 , 培养基和微生物的代谢产物中有明显的生物
第 2期
郑东虎等 . 利用微生物转化维生素 D3 的研究 (
110
科
技
通
报
第 20 卷
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薄层层析分析 在高效薄层层析板上用已筛选出的推动剂对
提取液进行薄层层析 . 1. 6 高效液相色谱分析 分析条件 : 采用甲醇为流动相, 蒸馏水 ( 9 1) ,
柱温是 50 ; 波长是 256 nm, 色谱柱是 ZORBAXC RPSM - 300( 10 m) ; L 为 250 mm; D 为 4. 6 mm; 流速 是 1. 0 mL/ min. 标样的试剂由德国默克公司有偿提 供. 将在高效薄层层析板上分离出的斑点部分刮
( 1. 天津农学院农学系 , 天津 300384; 2. 天津农学院水产系 , 天津 300384; 3. 天津农学院农工系 , 天津 300384; 4. 天津市农业科学院 示范区, 天津 300384)
)
枝1
摘 D3
要 : 根据目标菌株的生物学特征等筛选出若干菌株 , 还成功地利用入选菌株将 维生素 D3 转化成为活 性维生素 25( OH) D3, 并采用已建立的薄层 层析 和高效 液相 色谱等 检测 方法 对入选 菌株 的活性 进行 了鉴定 . 结 果表 25( OH) D3 的功能 .
)
25( OH) D3 的生物转化
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图 3 25( OH) D3 标样和转化物的 25( OH) D3 高速液相色谱分析情况
( a) 25( OH) D3 的标样 ( a) the sample of 25( OH) D 3 ( b) 转化物中的 25( OH) D3 ( b) the product of 25( OH) D3 [ 1] Koyama T, Shibakura M, Ohsawa M, et al . Anticoagulant Effect s of 1alpha , 25 -Dihydroxyvit amin D3 on Human Myelogenous Leukemia Cells and Monocytes[ J] . Blood, 1998, 92: 160- 167. [ 2] POLLY P, HERDICK M, MOEHREN U , et al . VDR -Alien: a novel, DNA - selective vitamin D3 receptor - corepressor partnership [ J] . FASEB, 2000, 14: 1455- 1463. [ 3] Bury Y , Ruf D, Hansen C M, et al . Molecular Evaluation of V it a min D3 Receptor Agonists Designed for Topical Treatment of Skin Diseases [ J] . Invest Dermat ol, 2001, 116: 785- 792. [ 4] O Kelly J, Hisat ake J, Hisat ake Y, et al . Normal myelopoiesis but abnormal T lymphocyt e responses in vitamin D receptor knockout mice [ J] . Clin Invest , 2002, 109: 1091- 1099. [ 5] Cross T. The actinomycet es[ M ] . 1994, Pp. 605 -623. In Holt J. G. , N. R. K rieg, P. H. A . Sneat h, J. T. St aley and S. T. Williams ( ed. ) , Bergey s M anual of Dwterminat ive Bact eriology. 9th, Williams & Wilkins, Balt immore.
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Abstract: According to the biology characteristics of target fungoid, some actinomyces were screened. Only the target actinomyces could translate VD3 into active VD3 25( OH) D3. And then HPLC and TLC were used to detect the activities of the actino myces. All of the results showed that actinomyces TN - 955 had the excellent translation function. Key words: microbiology ; actinomyces; active VD3 25( OH) D3; transformation; detection
明 : 放线菌菌株 TN - 955 具有把维生素 D3 转化成为活性维生素 D3 关键词 : 微生物学 ; 放线菌 ; 活性维生素 D3; 转化 ; 检测 中图分类号 : Q939. 97 文献标识码 : A
文章编号 : 1001- 7119( 2004) 02- 0109- 03
Research on the Active VitaminD3's transformation by microorganism ( 25( OH) D3's Biology Translation
图 1 活性维生素 D3 25( OH) D3 的结构 Fig. 1 The structure of active vitamin D3 25( OH) D3
出, 再次溶解、 离心 后, 用高 速液相 色谱仪进 行分 析.
的土壤中采集了 15 cm 以下的土壤作为供试样品, 进行分离 . 培养基配方 : 葡萄糖 10. 0 g 、 酵母膏 1. 0 g 、 细菌 用蛋白胨 2. 0 g 、 牛肉膏 1. 0 g 、 琼脂 18. 0 g 、 维生素 B 1 0. 5 mg 、 维生素 B2 0. 5 mg 、 烟碱酸 0. 5 mg 、 维生素 B 6 0. 5 mg 、 肌醇 0. 5 mg 、 泛酸盐 0. 5 mg 、 维生素 Bx 0. 5 mg、 维生素 H 0. 25 mg 、 蒸馏水 1000 mL 等, 并将 培养基的 pH 调节在 7. 0~ 7. 2 之间 . 筛选方法 : 在 28 的条件下培养 2 个月, 每隔 30 d 左右就对基质上菌丝的有无、 孢子数及形态、 孢子囊的有无及形态等进行观察, 从中筛选出可能 的放线菌菌株. 将一个能把维生素 D3 转化为活性 维生素 D3 25( OH) D3 的菌株视为活性放线菌菌 株, 并暂命名为 TN - 955. 1. 2 液体培养基 液体培养基 的主 要成 分为 淀粉 1% 、 麦芽 糖 1% . 把 TN -955 菌株的固体菌种接种在液体培养基 上, 在适当的条件下震荡培养 72 h. 把 2% 的液体菌 种接种在 50 mL 液体培养基中, 在同样的条件下震 荡培养 48 h, 之后再加入适量的底物继续震荡培养 48 h. 1. 3 底 物
底物为浓度大于 97% 的维生素 D3 , 由德国默 克公司提供. 1. 4 提 取 在培养的产物中加入等量提取液后 , 混合 , 分 液, 并将下层部分进行真空干燥. 已干燥的物质用 适当的溶剂溶解后, 在 - 21 下放置 30 min, 吸取 上层部分进行高效薄层层析. 分离出的斑点溶解后 用高速液相色谱进行分析 .
Fig. 2 TLC analysis of the sample and the product of 25(OH) D3
the the the the biology product of 25( OH) D3 ; sample of 25( OH) D3 biology product of 25( OH) D3 ; biology product of 25( OH) D3 + the sample of 25( OH) D3
大量研究表明, 维生素 D3 在人体内具有调节 Ca 和 P 代谢的功能 , 其中又以活性维生素 D3 的生 理作用最强 . 虽然, 活性维生素 D3 有 1 ( OH) D3 、 25 ( OH) D3 ( 结构见图 1) 和 1 , 25( OH) D3 等 3 种形式, 但以 1 , 25( OH ) 2D3 的生理作用 最佳