氧化应激心肌细胞prohibitin表达与分布变化及其生物学意义

3基金项目:国家自然科学基金资助课题(30570753)收稿日期:2006203231;修回日期:2006212228作者简介:任　哲(19792),女,内蒙古包头人,硕士在读,从事应激医学研究。

△通讯作者氧化应激心肌细胞prohibitin 表达与分布变化及其生物学意义3任　哲,钱令嘉△,杨志华(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)摘要　目的:探讨prohibitin 在氧化应激心肌细胞中的表达与分布变化的特点及其在心肌细胞损伤中的意义。

方法:H 2O 2干预体外培养乳鼠心肌细胞,建立氧化应激心肌细胞损伤模型;采用生物化学法检测细胞培养液中LDH 活性及M TT 实验观察心肌细胞损伤程度;以Western 印迹法检测氧化应激时prohibitin 蛋白表达变化与分布变化;线粒体H +2A TPase 合成活力实验检测线粒体氧化磷酸化功能;流式细胞术检测线粒体跨膜电位。

结果:氧化应激组LDH 活性显著高于对照组,而细胞存活率低于对照组34151%～6515%;线粒体H +2A TPase 合成活力降低60%;氧化应激组线粒体跨膜电位显著低于对照组;心肌细胞prohibitin 表达水平在H 2O 2处理3h 出现升高然后回落到正常水平,线粒体prohibitin 表达水平高于对照组。

结论:氧化应激心肌细胞prohibitin 表达水平代偿性增加并有向线粒体移位的趋势,氧化应激导致心肌细胞线粒体功能障碍。

关键词:　prohibitin ;　氧化应激;　线粒体;　心肌损伤中图分类号:R363文献标识码:A文章编号:100026834(2007)022******* 在一些损伤因素的作用下,细胞内的氧化代谢物增加,或细胞中抗氧化机制不足时,促使活性氧堆积,对细胞产生毒性,这种氧化和抗氧化的不平衡就是氧化应激[1]。

近年来的研究表明,氧化应激是多种不利因素,如运动、心理应激、缺血、缺氧等造成心肌细胞损伤的共同机制。

对氧化应激致心肌损伤发生的规律及其分子基础已进行了大量的研究,发现线粒体作为氧化应激的主要靶标,活性氧可引起线粒体结构和功能损伤,但对其损伤机制仍不明确。

本实验室前期对应激心肌细胞线粒体蛋白质组学研究,发现慢性束缚应激大鼠心肌细胞线粒体pro 2hibitin 表达水平明显升高[2]。

近来有研究发现,prohibitin 可以定位于线粒体并且有分子伴侣的功能[3,4],从而保持线粒体内膜的完整性。

但有关prohibitin 在氧化应激心肌细胞中的表达变化规律及其对线粒体的影响,目前尚未见报道。

本实验拟通过研究氧化应激时心肌细胞prohibitin 表达特点及其与线粒体损伤发生的相关性,为认识氧化应激致心肌细胞损伤机制提供实验依据。

1　材料与方法111　实验动物与试剂Wistar 乳鼠,体重10～14g ,40只(军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物房提供,Ⅱ级)。

乳酸脱氢酶(LDH )试剂盒购自中生北控公司。

prohibitin 单抗,购自Neomarkers 公司,Cox Ⅱ单抗,购自Molecular Probes 公司,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗,购自中杉公司。

Hoechst 33258、32(4,52二甲基噻唑22)22,52二苯基四氮唑嗅盐(M TT )、罗丹明123(Rh123)购自Sigma 公司。

112　氧化应激心肌细胞模型建立11211　心肌细胞培养　参照Paul Simpson 方法,开胸取乳鼠心脏,剪碎,用0125%胰酶消化法分离心肌细胞,细胞贴壁培养于10%胎牛血清M EM 培养液,37℃,5%CO 2培养箱。

选自律性搏动>100b ・min -1的心肌细胞用于实验。

11212　过氧化物诱导氧化应激模型建立　将培养3～4d 的心肌细胞培养液,换成含200μmol ・L -1H 2O 2,10%胎牛血清的M EM 培养液,37℃、5%CO 2培养箱,继续培养24h 。

113　细胞凋亡检测方法心肌细胞接种于011%多聚赖氨酸包被的盖玻片上,按照氧化应激模型建立方法处理细胞。

吸尽培养液,加入4%多聚甲醛固定液,固定30min ,去除固定液,PBS 晃动清洗5min ×3次。

加入浓度为1mg ・ml -1Hoechst33258染色液至终浓度1μg ・ml -1,染色15min ,PBS 晃动清洗5min ×3次,50%甘油封片,荧光倒置显微镜观察。

在显微镜同一视野下观察计数出现凋亡小体的细胞与全部细胞数目,两者进行比值计算,计算细胞凋亡率(%)。

114　乳酸脱氢酶(LD H)活性检测采用生物化学法,按照试剂盒要求测定。

1cm 光程比色杯中按要求加入工作液1ml,心肌细胞培养液200μl,混合均匀,37℃保温30s,读取初始吸光度,同时开始精确计时,1、2、3min时分别读取吸光度,确定每分钟吸光度变化(ΔA/min)。

LDH (U・L-1)=ΔA/min×8095。

115　心肌细胞活力测定用M TT比色法测定心肌细胞活力。

乳鼠心肌细胞接种于96孔板,根据实验目的确定培养时间长短,将原培养液换成无血清M EM培养基200μl/ well,每孔加M TT溶液(5mg・ml-1)20μl,37℃、5%CO2孵育4h,终止培养,小心吸取孔内培养液上清。

每孔加入150μl DMSO,振荡10min,使紫色结晶物充分溶解,酶联免疫测定仪在490nm波长处测定各孔的吸光度D(490)值。

116　心肌细胞线粒体提取收集心肌细胞,加入2ml预冷的分离介质(0125mol・L-1sucrose,0101mol・L-1Tris2HCl,015 mmol・L-1ED TA,011%BSA,p H714),手动匀浆。

采用差速离心法分离线粒体,即首先以700×g离心7min,弃沉淀,上清经10000×g离心10min,弃上清,用分离介质重悬沉淀,以同样高速离心1次,所得沉淀以悬浮介质(0125mol・L-1sucrose,0101mol ・L-1Tris2HCl,p H714)悬浮即制成线粒体悬液。

以上操作均在0～4℃进行。

蛋白定量采用Folin2酚法,线粒体用量根据其蛋白含量决定。

117　线粒体ATP合成速率测定采用荧光素-荧光素酶发光法[5],用20/20n 型发光仪测定。

反应温度25℃,在015ml反应体系中含有015mmol・L-1ED TA,10mmol・L-1hepes,5 mmol・L-1磷酸缓冲液,215mmol・L-1MgCl2,6 mmol・L-1malate,4μmol・L-1ADP。

记录以上体系中发光强度为本底,加入50μg线粒体后启动反应,记录发光强度。

以计算心肌细胞线粒体A TP合成速率:nmol・s-11mg-1pro表示118　心肌细胞线粒体跨膜电位检测利用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化。

取各组心肌细胞用0125%胰酶消化后,加Rh123至终浓度25μmol・L-1,避光孵育30min,PBS洗两次,1 000r・min-1离心10min,流式细胞仪检测,激发波长2发射波长为488～525nm,每份样本获取1×104个细胞,Cell Quest软件分析细胞平均荧光强度。

119　蛋白质印迹试验检测氧化应激心肌细胞及线粒体中prohibitin表达变化蛋白样品采用Bradford法蛋白定量后,按照标准上样。

应用SDS2PA GE电泳后,转移至PVDF 膜。

含5%脱脂牛奶的PBS封闭1h后,加1∶400稀释的一抗,室温2h,PBS洗膜3次,加1∶5000稀释的二抗,室温45min,洗膜3次,鲁米诺化学发光法显色。

凝胶图像分析系统,扫描图像。

1110　统计分析实验数据用均数±标准差( x±s)表示,组间比较用t检验。

2　结果211　氧化应激致心肌细胞损伤H2O2处理组与对照组相比,细胞培养液中LDH值均显著升高(P<0105,图1),显示200μmol ・L-1H2O2对心肌细胞结构功能造成严重损伤; M TT实验显示H2O2处理组细胞活力显著低于对照组(P<0105,图2)。

通过Hoechst染色观察对细Fig11　E ffects of oxidative stress on LDH activity in medium of cardiomyocytes(U・L-1)( x±s,n=6)3P<0105vscontrolFig12　E ffect of oxidative stress on cardiomyocytes by M TT [D(490), x±s,n=6]3P<0105vs control胞凋亡形态学检测,正常对照组细胞核呈均匀的蓝色,染色质未出现凝集;H 2O 2处理组细胞核,表现出核染色质固缩集聚至核膜周边形成致密浓染,或新月形、呈块或碎裂状改变,呈现典型的细胞凋亡形态学变化(图3)。

细胞凋亡率与对照组相比有明显升高(P <0105,图4)。

Fig 13　Apoptosis of cardiomyocytes staining by Hoechst 33258(×400)A :Control group ;B :H 2O 2treat 6h ;C :H 2O 2treat 12h ;D :H 2O 2treat 24h.Arrow :Apoptosis cellFig 14　Apoptosis rate of cardiomyocytes treated by H 2O 2( x ±s ,n =6)3P <0105vs control212　细胞线粒体功能的变化对照组心肌细胞线粒体A TP 合成速率(nmol.s -11mg -1pro )为1567183±228133,H 2O 26h 、12h 、Fig 15　Change of A TP synthesis rate in mitochondria of ox 2idative stress injured cardiomyocytes ( x ±s ,n =6)3P <0105vs control24h 处理组心肌细胞线粒体A TP 合成速率分别下降为547155±92166,646179±147166和670116±122133,与对照组相比具有显著性差异(P <0105,图5)。

流式细胞术检测线粒体跨膜电位,发现H 2O 2作用6h 后,心肌细胞线粒体膜电位较对照组显著降低52%(P <0105,图6),并且在H 2O 2处理12h ,24h 后,线粒体膜电位仍然处于较低水平。