单细胞RNA测序的样本制备指南

单细胞RNA测序的样本制备指南

在开展单细胞RNA测序之前，我们首先要妥善地制备单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和建议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x Genomics 的Chromium? Single Cell 3’ Solution，不过也同样适用于其他方案。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的工具，让研究人员能够揭开复杂的生物学系统，分析各个细胞的基因表达动态，从而深入了解疾病发展过程中的细胞进程。在此之前，分析混合细胞群体的基因表达一直是一项困难的任务。

当然，在开展单细胞RNA测序之前，我们首先要妥善地制备单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和建议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x Genomics的Chromium? Single Cell 3’ Solution，不过也同样适用于其他方案。

了解您的样本样本制备的具体方案因样本类型而异，但无论采用哪种方案，您都必须要确保上样的细胞是有活力的，并且完全解离成单细胞。无论是细胞系还是组织，优化细胞解离的操作都是必不可少的，这样才能避免细胞死亡和裂解。死细胞会裂解，释放出RNA。这种游离RNA会增加背景噪音，影响单细胞数据的质量。

目前有不少现成的样本制备方案，但也许需要针对您的样本类型来修改。比如，悬浮细胞系、磁珠富集的细胞和流式分选的细胞已经呈悬浮状态，只需要洗涤和计数即可。不过，如果样本换成了组织，那就有必要精心优化解离操作，以确保数据质量最高。

另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在RNA含量上相

距甚远，而准确测定此参数将影响一些关键决定，比如文库制备过程中的PCR循环数。举个例子，人外周血单核细胞（PBMC）的RNA含量极低，只有0.75 pg/细胞，而HCC38细胞系则富含RNA，含量达到21.6 pg/细胞。

处理也要小心移液相信大家都对自己的移液技术充满信心，不过，在处理解离的组织或悬浮的细胞时，还是要格外小心。比如，当细胞静置在管中时，它们开始沉降，因此每次从管的上部或下部吸取时，有可能吸到不同数量的细胞。正确的做法是每次移液之前先混合细胞悬液，然后从管的中部吸取。同时，细胞必须被温柔对待。大家可能不知道，即使用宽口径的移液吸头，移液混合也会对样本质量产生负面影响。下图比较了在HEK293T细胞上开展的四种不同的细胞混合实验对单细胞数据的影响。剧烈的移液混合和涡旋振荡都会导致细胞过早溶解，释放出RNA，形成背景噪音，最终降低细胞的reads比例。正确的做法是使用宽口径的吸头来轻柔混合细胞悬液。洗涤在处理悬浮细胞、解离组织或大量细胞时，

强烈建议彻底洗涤。这可以根据样本类型以及scRNA-seq 方法来调整。建议的洗涤方案是用含有0.04% BSA的PBS 来沉淀和重悬细胞两次，然后用最终体积的PBS和0.04% BSA来重悬细胞。

过滤大的细胞团块或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风险。为了避免这种状况，建议在上样之前使用细胞滤网（cell strainer），孔径大约为30-40 μm。不过需要注意的是，每次过滤都会造成细胞悬液体积的损失以及细胞浓度的改变。因此，如果需要过滤，在过滤之后应该对细胞重新计数。

细胞计数和活力评估在洗涤和过滤之后，我们有必要测定细胞活力，以便评估样本质量。尽管方法很多，但简单的台盼蓝染色方法就不错，能够鉴定出活细胞和死细胞的比例。此外，我们还需要开展细胞计数，准确了解样本中有多少个细胞。血细胞计数器当然可以用，不过还有更方便的计数工具，如赛默飞的Countess II FL全自动细胞计数仪。

影响细胞计数准确性的一个重要因素是细胞储液的浓度。研究发现，细胞储液的浓度在700-1200个细胞/μl的范围内是最理想的。超出这个最佳范围，可能导致细胞计数的结果不可靠。如果样本不在这个范围内，建议相应地调整细胞储液的浓度。

去除死细胞样本中高比例的死细胞可能会影响目标细胞的

回收率。死细胞及其他污染物的去除对获得高质量的数据至

关重要。当然，样品中的死细胞比例可能差异明显，这要取决于样本类型和制备方法。对于死细胞比例较高的样本，您可以参考10x Genomics的技术指南（Removal of Dead Cells from Single Cell Suspensions Improves Performance for 10x Genomics? Single Cell Applications）。

样本保存为了尽量避免转录组的变化，在洗涤和计数之后，单细胞的悬液应保存在冰上，等待后续的文库构建。在理想情况下，一旦样本制备好，应尽量在30分钟内使用。

不过，样本在冰上具体能放多久，这也关乎到细胞类型。有些细胞（如PBMC）如果长时间放在冰上，就会形成团块。这些团块很难解离，增加了堵塞芯片的风险，而且每个团队都被当成一个细胞，又降低了计数的精确性。在这种情况下，我们应当尽量缩短放置的时间。

结语在制备单细胞悬液时，提前规划和精心准备是必不可少的，因为全面考虑各种因素，才有望获得高质量的数据。10x Genomics等公司提供了单细胞样本制备的许多指导，也提供了特定细胞类型的示范方案。如果您的研究对象难以分离到完整细胞，则可以选择新近开发的细胞核分离方案。