基因工程第三章基因工程载体

2021/3/2
基因工程第三章基因工程载体
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧 光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌
（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化
还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠 杆菌菌落呈蓝色。
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2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ， Neor
b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的 氯霉素不能结合在核糖体上。
1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合
位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记
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遗传标记基因
1. 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主 细胞
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非 选择性的（如lacZ）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
* 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的 （如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。
**有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用 时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采 用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择 性标记基因（lacZ，GUS等）。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛， 因为许多生物中没有这种基因。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和 Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细 胞内。
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如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977,
Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆
位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不
同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体， 表达型载体及各种探针型载体。
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5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。 前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者 都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两 个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称 之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可 作为标记基因。
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基 因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3， LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
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3. 使用标记基因注意要点
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质 分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一 种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子 进入细菌细胞。
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分子克隆载体的复制起点与种类
1. 复制起点的种类
1) 核内复制起点
a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线状)染色体