第五章 酶法分析技术(NO)

2
酶法分析的方法
酶法分析主要优点
酶作用的特异性高
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品 对环境的污染；
酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。
酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范 围等方面都优于传统的化学法
1
酶法分析的理论基础
终点法 酶法分析 反应速率法
可以看出整个反应过程，可以大致分为二个时期。一开始为 动态期，化学反应按一定速度进行，反应物浓度随时间而变化， 且变化程度不断变小，到一定时间，化学反应或者达到平衡，或 者反应达到终点，此时反应速度为零，反应物浓度不变。按所用 方法所测定的反应是在达到平衡前还是平衡后。分别命名为动态 法或平衡法/终点法。
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
速率法和平衡法测定比较
区别 速率法 平衡法
测定时间 检测速度 检测成本 产物堆积 样品色原 测定仪器
较短 较快 酶用量小，成本低 影响较小 影响较小 要求电噪声小，A读准到 0.0001，温差<0.1%
较长 较慢 酶用量大，成本高 影响较大 影响较大 要求不严
转换反应 循环反应 指示反应
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
甘油浓度测定
ATP 甘油
GK
ADP
NAD+
G-3-PDH GPO
NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 H2O2
甘油-3-磷酸 O2
通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复
循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环 不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计 的量决定于t 和每min循环次数。
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
血淸胆汁酸测定
Thio-NAD+
3α -HSD
Thio-NADH(黄色) 循环
3α -HSD
胆汁酸 NAD+
3-酮类固醇 NADH
胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代
还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测 物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。
二、终点法的种类
单酶反应定量法
偶联酶反应定量法
（1 ） 单酶反应定量法 单酶反应只需要一种催化酶，如下式所示
用这种反应作底物定量时，可以测定底物 的减少量，也可以测定产物的增加量。对 含有辅酶的酶，测定辅酶的变化量也是有 效的方法。
1. 底物减少量的测定
在待测物质为底物的酶反应中，如果底物能
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
草酸 甲酸 + CO2
瓦式呼吸计测定生成的CO2的量
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O

尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+

谷氨酸 + H2O + NAD+
另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率 法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对 速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。 由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。
返回章目录
(3)
酶循环法
利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促
反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应
接近完全地转化为产物(当有99％转化成产物 时，则认为反应完全)，而且底物又具有某种 特征性质(如具有特殊的吸收光谱)时，就有 可能直接测定底物的减少量而定量待测物。
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O

UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
(1)
终点法基本理论
终点法又称为总变化量法，先借助酶反应(单独的反应
或几种酶构成的稠联酶反应)使被测物质定量地进行转变，
在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质(第二底物) 等的变化量，因此称为终点测定法(end-point method)。

终点法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
2. 产物增加量的测定 在被测物作为底物的酶促反应中，如果底物 基本上都能转变成为产物，而产物又具有可 专一性进行定量测定的物质，那么，根据产 物的增加量就能检测底物的量。
草酸的测定
系统。
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
第五章
酶法分析技术
酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
以酶为分析对象的分析方法
酶法 ——酶活力测定法
以酶为分析工具或分析试剂的分析方法 ——酶分析法
原理和方法：以酶能专一而高效地催化某些化学反应为 基础，通过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定 而检测相应物质的含量。
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。

体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
脱氢酶指示系统
血百度文库葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P +

G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+