二代测序NGS实验方法和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：

全基因组从头测序或者重测序

目标序列重测序

转录组分析

微生物组研究

基因调控研究

NGS序列

二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。?

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-timePCR一样，自己进行测序。这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。目前，这些仪器的通量在10Mb到7.5Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600Gb的序列。一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500bp），但是其精度和测序能力（90Mb）要低很多。还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800bp，700Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序

二代DNA测序的工作流程如下：

DNA样本制备

文库构建和验证

文库分子大规模平行克隆扩增

测序

?

二代测序DNA样本的质量控制

首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。

凝胶电泳法

基因组DNA的完整性和大小，可以用常规或者脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)来检测。常规的凝胶电泳的精确度不高，这是因为大的DNA分子在凝胶中移动的时候，本质上是用一种与尺寸无关的方式一起移动的。但是，它仍然能够提供完整性（大小范围）和纯度（RNA 污染物在凝胶底部形成脱尾条带）方面的有效信息。因此，它仍然是评价基因组DNA质量的有效方法之一。

注：RNA污染会导致DNA浓度高估，并且抑制一些下游步骤。如果能肯定有RNA污染，则可使用去DNase的RNaseI处理样本。

分光光度测定法

分光光度仪在260nm和280nm处读数的比例（A260/A280）可以用来估计DNA相对于一些吸收紫外光的杂质（比如蛋白）的纯度。纯净的DNA的A260/A280比例大约为1.7–1.9。

注：想要获得精确的A260/A280值，需要在弱碱性的缓冲溶液中测定吸光度(比

如,10mMTris?Cl,pH7.5)。

第二个步骤是测定基因组DNA的浓度。

分光光度法

DNA的浓度可以通过使用分光光度仪测定其在260nm波长的吸光度来确定。Nanodrop目前被广泛使用，因为它需要的样本量少(1μl)，并且使用方便（不需要比色皿）。为了确保结果的可靠性，读数应该在0.1到1.0之间。?

注：吸光度测定不能区别DNA和RNA。RNA污染物会导致DNA浓度高估。但是，纯净RNA的A

/A280比值在2.0左右，而纯净的DNA大约为1.8。因此，如果这个值为1.95，那么说明260

样本里面有RNA杂质。

注：苯酚在270–275nm的波长范围内有最大的吸光度，非常接近于DNA。因此苯酚能提高样本在260nm附近的吸光度，从而导致高估DNA的产量和纯度。

荧光法

荧光法使用荧光染料测定DNA的浓度，具有特异性和灵敏性。Hoechst33258结合到DNA上后，能增大458nm波长附近的发光强度，除此之外，也可以使用一些更加灵敏的荧光染料，比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的实验，比紫外吸光光度法灵敏10，000倍，而比使用Hoechst33258染料的方法至少灵敏400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen 实验对双链DNA的选择性要远高于RNA和单链DNA。

DNA标准品和样本与荧光染料混合，并且使用荧光计检测。将样本的测定结果与标准品的测定结果相比较，以确定DNA的浓度。

Real-timePCR?

可以使用real-timePCR技术来测定DNA样本的数量和质量。多重PCR技术使用引物集在多个位点扩增不同大小的片段，是检测DNA损伤和片段化的有效质控手段。此类技术试验专门测定可经PCR扩增，适于二代测序的DNA分子。上述提到的这些常规方法，通常不能测定的样本中扩增得到的DNA的量，或者会高估了DNA的量。与它们相比，real-timePCR更加适用于预测DNA样本是否适合于二代测序。?

文库制备

对于大多数商业化的二代测序平台，使用诸如桥式扩增或者乳液PCR方法，对文库中的DNA 片段进行克隆扩增，以产生足够拷贝数量的测序模板非常必要。通过将平台特异性的适配子与感兴趣的DNA源（比如基因组DNA、双链cDNA或者PCR扩增子等所产生的DNA片段）退火，得到片段文库。适配子序列的存在，使得我们可以对文库分子进行选择性的克隆扩增。因此，这种方法不需要像传统的方法那样，在微生物中间体中，对基因组片段进行微生物克隆。另外，适配子序列中，还含有平台特异性的测序引物的结合位点。

通常情况下，一个常规的DNA文库构建方案包含四步：

片段化DNA