单克隆抗体糖基化修饰研究进展_王冲

收稿日期：２０１７－０２－

１４作者简介：王冲（１９８２－），女，免疫学博士，先后从事单抗药物开发及药品审评核查工作

通信作者：王冲（Ｅ－ｍａｉｌ：１８０４９８２３０５７＠１６３ｃｏｍ）

单克隆抗体糖基化修饰研究进展

王冲

（上海药品审评核查中心，上海　２０１２０３

）摘要：糖基化修饰对单克隆抗体的结构、功能及药代动力学会产生影响。不同糖型结构通过与ＦｃＲｓ、Ｃｌｑ以及新生Ｆｃ受体（ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦｃＲｎ）的结合而分别调节抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤ－ＣＣ）、补体依赖的细胞毒作用（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）以及ＦｃＲｎ介导的药物消除半衰期。不同的细胞表达系统和细胞培养条件均会对糖基化的类型及程度产生影响，进而影响治疗性抗体的疗效以及安全性。通过糖基化工程可以控制特定糖型的形成，进一步优化单克隆抗体的效应功能和降低免疫原性。本文就单克隆抗体糖基化修饰研究进展进行综述。

关键词：单克隆抗体；糖基化；表达系统；药代动力学

中图分类号：Ｒ３９２．１１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－２４７８（２０１７）０３－２４７－

０６ 近年来，单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ

，ｍＡｂ）作为治疗性抗体在生物制药领域发展得越来越快，主要应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等的治疗领域。单克隆抗体是蛋白类大分子，具有复杂的结构特征，主要由Ｆａｂ和Ｆｃ两大功能区组成，在Ｆａｂ和／或Ｆｃ段特定的位点存在糖基化修饰。糖基化修饰形成的糖链仅仅占整个单抗的３％，尽管比例不高，但糖链结构却发挥着重要的作用。由糖基化修饰形成的糖链结构能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构，抗体脱糖基化后对热的稳定性大大降低，糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解。糖链中特别的糖型还与免疫效应功能密切相关，糖型并非在人体内生物合成，因此可能具有一定的免疫原性，可加速单抗的血浆清除。总体上，糖基化修饰不仅对维持单抗的结构有重要作用，同时一些特定的糖基化修饰类型以及不同的糖基化修饰程度均会影响抗体的安全性特征，而且，糖基化修饰可以同时影响药物的有效性特征。

１　糖基化修饰对治疗性抗体疗效、安全性

及药代动力学的影响

同大多数胞外糖蛋白一样，抗体在细胞的内质

网和高尔基体内发生糖基化过程。ｍＡｂ在Ｆｃ段的Ａｓｎ－

２９７都有一个保守的Ｎ糖基化位点，仅有２

０％的ｍＡｂ在Ｆａｂ段存在第２个Ｎ糖基化位点，这２个糖基化位点都位于ｍＡｂ的重链上。研究发现糖链中不同末端糖基化对Ｉｇ

Ｇ功能有不同的影响［１］

。Ｉｇ

Ｇ因不同的连接方式存在３种不同类型的Ｎ糖，分别为高甘露糖型、

杂合型、复杂型。杂合型和复杂型大多数存在核心岩藻糖基化，也有的没有核心岩藻糖基化。ｍＡｂ是特殊的免疫球蛋白，Ｎ糖比例相对较少，并且几乎没有超过两分支的Ｎ糖，唾液酸的含量也相对较低。整体来说，ｍＡｂ的糖型大多数以复杂型两分支伴随核心岩藻糖基化的结构存在。

ｍＡ

ｂ的糖基化结构与其效应功能之间密切相关，Ｆｃ段作为ｍＡｂ的效应功能区与ＦｃＲｓ结合发挥抗体依赖细胞毒作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏ－ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）、激活Ｃｌｑ发挥补体依赖的细胞

毒作用（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）、与新生Ｆｃ受体（ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐ

ｔｏｒ，ＦｃＲｎ）结合介导清除作用，糖基化修饰通过影响Ｆ

ｃ段功能区的结合来调节ＡＤＣＣ、ＣＤＣ以及药物消除半衰期［２］

。在２０世纪８０年代早期的研究证实：

无糖基化修饰的ＩｇＧ丧失与Ｃｌｑ和ＦｃＲｓ结合的能力，因此不能引发ＣＤＣ和ＡＤＣＣ作用。Ｆａｂ段和Ｆ

ｃ段特定的糖基化修饰还会诱发免疫原性。对ｍＡ

ｂ疗效、安全性及药代动力学的影响较显著的糖基化作用如下。

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２·《现代免疫学》２０１７年第３７卷第３期

１．１　核心岩藻糖基化作用　Ｊｅｆｆｅｒｉｓ等［１］研究证实，一定量的核心岩藻糖基化对于ＦｃＲｓ的识别以及Ｃｌｑ的活化是必需的。体内外研究证实核心岩藻糖是影响ＡＤＣＣ活性最重要的糖基化结构。Ｋａｎｄａ等［３］研究进一步证实相对含有核心岩藻糖结构的杂合型单抗来讲，无核心岩藻糖基化结构的单抗具有相对较高的ＦｃγＲＩＩＩａ结合能力及ＡＤＣＣ活性；但核心岩藻糖基化结构与ＣＤＣ活性的提高无关。

中国仓鼠卵巢（Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ，ＣＨＯ）细胞是真核细胞表达系统，因其自身的细胞表达特点，常常选择作为治疗性单抗的产生细胞系。大约９０％常规ＣＨＯ细胞产生的重组ＩｇＧ的Ｆｃ段糖链中含有核心岩藻糖。为了提高抗体与ＦｃγＲＩＩＩａ的结合活性以及ＡＤＣＣ活性，人们已采用多种方法来降低重组ＩｇＧ的岩藻糖基化修饰水平，包括采用α－１，６岩藻糖基转移酶基因敲除或低表达的细胞系，或ＧｎＴＩＩＩ的高表达（平分型Ｎ乙酰葡糖胺转移酶的添加导致核心岩藻糖含量下降）进行重组ＩｇＧ的产生［４］。

１．２　半乳糖基化作用　大约９５％常规ＣＨＯ细胞产生的重组ＩｇＧ以半乳糖为末端糖。通过体外细胞培养或者血清纯化得到的ＩｇＧ含有１个或２个半乳糖残基。末端半乳糖基化对Ｆｃ段的构象形成有很大的作用，研究结果表明仅仅核心岩藻糖基化并不会对Ｆｃ段的构象形成产生影响。

细胞的培养条件可对所产生抗体的Ｆｃ段末端半乳糖基化修饰水平产生明显影响，即糖型的微异质性。基础培养基成分、补料培养基成分、细胞代谢物累积等均会影响糖基化修饰的程度。批次培养中限定的葡萄糖浓度将降低末端半乳糖的含量［３］。生物反应器中工艺参数的变化将对单抗的糖型产生影响并最终影响成品的质量。Ｉｖａｒｓｓｏｎ等［５］提出一套实验方法学，用于研究批次培养中各个工艺参数的变化。研究结果表明ｐＨ值在６．８～７．８变化时，半乳糖基化及唾液酸化程度的变化达到近５０％。溶氧变化在（１０～９０）％，半乳糖基化的变化最大达到２０％，唾液酸化的变化达到３０％。未观察到渗透压对单抗糖基化的影响。

现已明确，Ｆｃ段末端半乳糖基化水平影响ＩｇＧ的ＣＤＣ活性，其程度下降将导致ＣＤＣ活性减弱。目前，尚未有研究确证关于Ｆｃ段末端半乳糖残基对于ＩｇＧ药代动力学特征的影响。

Ｄｉｏｎｎｅ等［６］新近的研究结果表明，在细胞培养过程中随着细胞生长，氧化还原电位降低，或者还原剂二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）浓度升高，半乳糖基化指数均随之下降，这种改变主要反映在无半乳糖基化以及无唾液酸化糖型结构的增多。ＤＴＴ浓度增高以及半乳糖基化指数下降可能与单抗组装过程中的二硫键被破坏增多有关，这种组装路径的改变将最终改变单抗的糖型结构，并且将作为控制单抗特定糖型结构的一种机制。１．３　唾液酸化作用　据研究报道，存在４０多种不同的唾液酸化类型，但在生物制药领域应用的哺乳动物表达系统中主要存在２种类型的唾液酸，分别是Ｎ－乙酰神经氨酸（Ｎｅｕ５Ａｃ，ＮＡＮＡ），Ｎ－羟乙基神经氨酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ，ＮＧＮＡ）。正常情况下，人类的ＩｇＧ中含有的唾液酸化类型为Ｎｅｕ５Ａｃ，而小鼠的ＩｇＧ中含有的唾液酸化类型为Ｎｅｕ５Ｇｃ。后者含量的增加，可能使体内产生抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体，因此生物制药生产过程中需要密切监测Ｎｅｕ５Ｇｃ。

研究发现Ｆｃ段唾液酸的含量越高，与ＦｃＲｓ的结合活性就越低，从而导致ＡＤＣＣ活性降低，其与细胞表面抗原的结合活性也随之降低［７］。

早在２０世纪７０年代，就有证据表明Ｆｃ段唾液酸化程度对糖蛋白的药代动力学有显著影响。研究表明，末端唾液酸残基可延长重组糖蛋白的体内血清半衰期［８］，使去唾液酸的糖蛋白被更快地清除。末端唾液酸残基可以阻止血清糖蛋白与肝脏中存在的无唾液酸糖蛋白受体的结合，此受体主要识别末端半乳糖残基。

１．４　甘露糖基化作用　研究证实大多数情况下高甘露糖结构具有很强的免疫原性，在哺乳动物细胞表达系统中产生的单抗可被检出很少量的高甘露糖结构，在产生过程中应该尽量降低高甘露糖结构的含量。对于重组单抗来说，Ｆｃ段甘露糖含量会随着培养细胞的变化而变化，在不同批次产品间也会有很大的变化［９］。糖蛋白包括重组单抗在体内的两大清除途径，除了与肝脏中存在的无唾液酸糖蛋白受体结合介导清除外，第二条清除途径是通过同肝脏中的巨噬细胞表面的甘露糖受体结合，将导致Ｆｃ段中存在高甘露糖结构的重组单抗在血浆中的快速清除［１０］，从而降低其效应功能。

１．５　其他聚糖特征　还存在着其他一些糖基化结构也可能会影响单抗的结构和效应功能，包括等分ＧｌｃＮＡｃ残基等，均会对药物的药代动力学特征及Ｆｃ效应功能产生不同程度的影响。研究发现，有

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