_1_抗胰蛋白酶的分离纯化及活力测定

０８５．０
０２．８
ＤＥＡＥ－ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
２ ３０５ １．６９ ０．５２
０４０．６
０８．９
ＣｏｎＡ－ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ２ ３３５ ６．０２ ０．２１
０１６．５
３１．７
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ ＨＲ ２ ３２９ ７．１３ ０．２０
０１５．７
３７．５
参考文献：
［１］ Ｓａ′ｎｄｏｒ Ｏｌａ′ｈ ｅｔ ａｌ． Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａ－ ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ａ － ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ， ２０００， ７４４： ７３－ ７９．
１ 材料与方法
１．１ 主要试剂与仪器 １．１．１ 试剂
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ， ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ， Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－ ２００， 均 为 Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ 公 司 产 品； 低分子量标准蛋白和胰蛋白酶标准品， 均为中国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 产 品Байду номын сангаас； ＢＡＰＮＡ， α１－ ＡＴ 标 准 品 ， 为 Ｓｉｇｍａ 产 品 ； α－ 甲 基 － Ｄ－ 葡 萄 糖 苷 ， 为
收稿日期： ２００６－ ０３－ １３ 作者简介： 何小维 （ １９５９－ ） ， 女， 广西人， 副教授， 研究方向： 功能碳水化合物材料理论技术。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｌｉｕｙｕ８００８１８＠１２６． ｃｏｍ。
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农产品加工·学刊
２００６ 年第 ４ 期
１．２．２ ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ 亲和层析 伴刀豆球蛋白亲和层析柱 （ １．０×２０ ｃｍ） ， 用 ｐＨ
（ ４） 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 首 次 对 番 茄 皮 渣 中 的 "－ 胡萝卜素做了定量分析。实验结果表明， 番茄皮 渣中的 "－ 胡萝卜素的含量在 ２０ ｍｇ／ｋｇ 以上， 具有较 高的营养价值和应用前景。
５
１０
ｔ／ｍｉｎ
图 １ β－ 胡萝卜素的色谱图
参考文献：
［１］ 赵法， 王本茂， 王德恺． 今日营养与健康［Ｍ］． 北京： 北京 金盾出版社， １９８４： ２１０－ ２１３．
（ ２） 取 #－ 胡萝卜素标准品溶于正己烷， 在紫外 － 可见分光光度计上扫描。结果表明 ４５１ ｎｍ 处 $－ 胡 萝卜素有最大吸收， 因此笔者采用 ４５１ ｎｍ 作为测定 波长。
（ ３） 在本实验条件下， 样品未经皂化， 使 得 %－ 胡萝卜素未被氧化损失， 减少了前处理步骤， 增加了 回收率。
９７ ４００— ６６ ２００— ４３ ０００—
３１ ０００—
２０ ２００— １４ ４００—
Ｍ１ ２ ３ ４ ５
Ｍ－ 低分子量标准蛋白 （ １４．４－ ９７．４ ｋＤａ） ； １－ 人血 α１－ 抗胰蛋白 酶 标 准 品 ； ２－ 硫 酸 铵 沉 淀 后 样 品 ； ３－ ＤＥＡＥ－ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 层 析 后 样 品； ４－ ＣｏｎＡ－ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ 层析后 样 品 ； ５－ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ ＨＲ 层 析后样品
０ 引言
α１－ 抗胰蛋白酶 （ α１－ ＡＴ） 是主要由肝细胞合 成的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂， 能抑制多种丝氨酸内 切肽酶 （ 如弹性蛋白酶、胰蛋白酶、血浆素和凝血酶 等） 活性。在电泳中， α１－ ＡＴ 迁移位点位于 α１ 蛋 白带， 因而又被称为 α１－ 蛋白酶抑制剂 （ α１－ ＰＩ） 。 α１ 抗胰蛋白酶是人血清中的一种含有碳水化合物单 链糖蛋白， 其分子量为 ５２ ０００ Ｄａ 左右。最初发现其 功能是抑制胰蛋白酶， 故而得名。后来发现它能对抗 多种以丝氨酸为活动中心的蛋白酶， 如胰凝乳酶、组 织蛋白酶、纤溶酶和凝血酶等， 尤其有重要生理意义 的是它能对抗白细胞弹性蛋白酶 （ ｎｅｕｌｒｏｐｈＺｌｅｌａｓｔａｌｅ， ＮＥ） ， 而且对抗 ＮＥ 的作用远比抑制胰蛋白酶的作用 大［１］。
Ａ２８０
２．５
２．０
１．５
１．０
０．５
０
０
５
１０
１５
２０
管数
图 １ ＤＥＡＥ Ｓ ｅ ｐｈａ ｒｏｓ ｅ Ｆａ ｓ ｔ Ｆｌｏｗ 弱阴离子交换 层析分离猪血清
Ａ２８０
２．５
２．０
１．５
１．０
０．５
０
１
６
１１
１６
２１
管数
图 ２ ＣｏｎＡ－ Ｓ ｅ ｐｈａ ｒｏｓ ｅ 亲和层析分离猪血清
１．２．３ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ ＨＲ 分子筛层析 分 子 筛 层 析 柱 （ １．６×３０ ｃｍ） 用 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ
（ 下转第 ５４ 页）
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２００６ 年第 ４ 期
应用本法对不同来源的番茄皮渣样品中的 !－ 胡 萝卜素含量进行了测定， 同时测定加标样品， 其中每 个样品做 ５ 次平行测定， 样品分析结果与加标回收试 验见表 １。
β－ 胡萝卜素
３ 讨论
（ １） 由于 "－ 胡萝卜素本身性状不稳定， 见光易 氧化分解， 所有操作应避光进行［３， ４］。
加入量 ｍｇ／ｋｇ
５０．０ ２０．０ ４０．０ ７０．０ ５０．０ ３０．０
回收率 ％
８４．７ ９５．６ ９６．４ ８９．９ ８２．３ ９５．２
相对标准偏差 ％
２．０ ３．２ ７．７ ２．８ ４．４ ５．０
［２］ 刘 会 臣． "－ 胡 萝 卜 素 对 肿 瘤 的 防 治 作 用［Ｊ］． 中 国 药 学 杂 ［５］ 夏薇， 陈新志． 烟叶中 "－ 胡萝卜素的分离纯化和测定［Ｊ］．
Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ 产品； 其他试剂均为分析纯。 １．１．２ 仪器
ＢＩＯ－ ＲＡＤ 电泳仪、紫外分光光度计， 上海棱 光 技术有限公司提供； 核酸蛋白检测仪， 上海康华生化 仪器制造厂生产。 １．２ α１－ 抗胰蛋白酶的制备［２￣６］
新鲜猪血离心后， 加入等体积的饱和硫酸铵溶 液， 轻轻搅拌均匀， 在 ４ ℃下静置数小时后过滤， 取 上 清 液 加 入 硫 酸 铵 固 体 粉 末 ， 使 饱 和 度 达 ７５％ ， 缓慢地加入并不断搅拌以免引起局部浓度过大， ４ ℃ 下静置过夜后， 过滤。将所得沉淀用 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ 值为 ６．４ 的磷酸缓冲液充分溶解后， 用纯水透析， 直 至无硫酸根离子。 １．２．１ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 弱阴离子交换层析
２００６ 年第 ４ 期
第 ４ 期（总第 ６１ 期）
农产品加工·学刊
Ｎｏ．４
２００６ 年 ４ 月
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ ｏｆ Ｆａｒｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
Ａｐｒ．
文章编号： １６７１－ ９６４６ （ ２００６ ） ０４－ ００５１－ ０２
α１－ 抗胰蛋白酶的分离纯化及活力测定
值为 ８．０ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 缓冲液平衡， 上样后继续用平衡液 洗脱， 收集各个峰值范围的洗脱液。最后透析浓缩。 用 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＯＨ 清洗， 将 ０．０２％ 的 ＮａＮ３ 在室温 下保存。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－ ２００ ＨＲ 凝胶过滤分离猪血清层 析见图 ３。
Ａ２８０
２．５
２．０
２ 结果与讨论
猪血清α１－ 抗胰蛋白酶纯化过程中 ， 蛋 白 含 量 及活力回收见表 １。
表 １ 猪血清 α１－ 抗胰蛋白酶纯化过程中 蛋白含量及活力回收
分离步骤
总蛋白
总活力 活力回收率
比活
纯化倍数
ｍｇ
×１０３
％
原猪血清 １００ｍＬ ６ ７１０ ０．１９ １．２７
１００．０
０１．０
硫酸铵沉淀
２ ０３５ ０．５３ １．０８
１．５
１．０
０．５
０
１
６
１１
１６
管数
图 ３ Ｓ ｅ ｐｈａ ｃｒｙｌ Ｓ － ２００ ＨＲ 凝胶过滤分离猪血清层析
１．３ 蛋白质含量的测定［７］ 以牛血清白蛋白为标准品， 采用双缩脲法测定总
蛋白含量。
１．４ ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳［８］ 分 离 胶 １２％ ， 堆 积 胶 ５％ ， 考 马 斯 亮 蓝 Ｇ－ ２５０
染色。低分子量标准蛋白 （ １４．４￣９７．４ ｋＤａ） 为参比蛋 白 ， 与 标 准 α１－ ＡＴ （ Ｓｉｇｍａ 公 司 产 品） 做 对 比 。 上 样量为 １８ μＬ， 电压开始为 ６０ Ｖ， 待指示剂全部进 入 分 离 胶 后 ， 电 压 提 至 １２０ Ｖ。 各 分 离 步 骤 的 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳图见图 ４。
值 为 ７．６ 的 磷 酸 缓 冲 液 （ 含 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ） 平 衡 ， 上样后用平衡缓冲液洗脱， 洗至基线后， 换用含有 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ α－ 甲基－ Ｄ－ 葡萄糖苷的洗脱液洗脱， 收 集活性峰值部分， 再用 ｐＨ 值为 ７．６ 的磷酸缓冲液透 析 ， ２０％ ＰＥＧ 浓 缩 。 用 ２０％ 乙 醇 再 生 ， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－ １００ 清 洗 亲 和 柱 ， 将 ０．０２％ 的 ＮａＮ３ 在 ４ ℃ 下 保 存。ＣｏｎＡ－ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 亲和层析分离猪血清见图 ２。
表 １ 样品分析结果与加标回收试验 （ ｎ＝５）
序号
样品来源
１ 新疆屯河沙湾番茄制品公司 ２ 新疆屯河玛纳斯番茄制品公司 ３ 新疆梨春番茄制品公司 ４ 新疆屯河科林番茄制品公司 ５ 石河子天业番茄制品公司 ６ 石河子天业番茄制品公司
测得量 ｍｇ／ｋｇ
５１．７ ２４．１ ４４．２ ７１．１ ４６．３ ２８．５
何小维， 刘 玉， 罗志刚
（ 华南理工大学 轻工与食品学院， 广州 ５１０６４０）
摘要： 以猪血清为原料， 经盐析、离子交换层析、亲和层析和凝胶过滤层析等过程， 制备较高纯度的 α１－ 抗胰蛋白
酶制剂。根据改良的 Ｅｒｉｋｓｓｏｎ 法， 采用苯甲酰－ ＤＬ－ 精氨酸和以硝基苯胺 （ ＢＡＰＮＡ） 为底物， 测定猪血清中 α１－ 抗
胰蛋白酶的抑制活力。
关键词： α１－ 抗胰蛋白酶； 层析； 活力
中图分类号： Ｑ８１４．１
文献标志码： Ａ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ α１－ ａｎｔｒｔｒｙｐｓｉｎ
Ｈｅ Ｘｉａｏｗｅｉ， Ｌｉｕ Ｙｕ， Ｌｕｏ Ｚｈｉｇａｎｇ （ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ α１－ ａｎｔｒｔｒｙｐｓｉｎ， ｓａｌｔ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ｉｏｎ－ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ， ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ａｎｄ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ． Ｂｙ ｃｈａｎｇｅｄ Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆα１－ ａｎｔｒｔｒｙｐｓｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ， ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ＢＡＰＮＡ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： α１－ ａｎｔｒｔｒｙｐｓｉｎ； ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ； ａｃｔｉｖｉｔｙ
图 ４ 各分离步骤的 Ｓ ＤＳ － Ｐ ＡＧＥ 电泳图
１．５ α１－ 抗胰蛋白酶活力的测定［９］ 以 ＢＡＰＮＡ 为 底 物 ， 将 α１－ 抗 胰 蛋 白 酶 与 一 定
量的胰蛋白酶作用， 测定胰蛋白酶剩余活力即可得出 α１－ 抗胰蛋白酶的抑制活力。定义抑制 １ｍｇ 胰蛋白 酶所需的 α１－ 抗胰蛋白酶的量为该酶的 １ 个活力单 位。此活力以每 １ｍｇ 的 α１－ 抗胰蛋白酶所具有的活 力单位来表示。
离 子 交 换 层 析 柱 （ ３．５×２０ ｃｍ） 用 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ 值为 ６．４ 的磷酸缓冲液平衡， 将上述透析液过柱， 先用 ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ 值为 ６．４ 的磷酸缓冲液洗脱至基 线， 换用 ０．１２ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ 值为 ６．４， 含 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 的磷酸缓冲液继续洗脱。收集有活性的峰， 并用 ｐＨ 值 为 ６．４ 的 磷 酸 缓 冲 液 在 ４ ℃ 下 透 析 ， ２０％ＰＥＧ 浓 缩 。 用 １ ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＣｌ 再 生 ， 将 含 有 ０．０２％ 的 ＮａＮ３ 在 室 温 下 保 存 。ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 弱 阴 离 子 交换层析分离猪血清见图 １。