第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
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目的基因克隆基因工程原理与技术刘志国课件ppt
PCR ● 增加了对不可培养微生物生理、生化和关键代谢机理的了解
DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同,
过程 （2）重组DNA分子导入受体细胞要方便。
以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增 目标DNA和载体浓度的确定 oligo（dT）-纤维素柱层析分离法 性，即形成可逆的瞬时通道，二ming recombination，RPR） 第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一
链
Strand ExchangeMutagenesis）
运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的单链
（正义引物） AGSP:基因特异引物
（反义引物）
盒式P CR原 理示 意图
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
第一节 PCR扩增法获得目的基因
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
方法 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否
已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易 高 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR )
反向PCR 以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增
第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA；
TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团
设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接
DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同,
过程 （2）重组DNA分子导入受体细胞要方便。
以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增 目标DNA和载体浓度的确定 oligo（dT）-纤维素柱层析分离法 性，即形成可逆的瞬时通道，二ming recombination，RPR） 第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点 设计两条引物GSP1和GSP2，GSP1在GSP2的外侧，以第三步中形成的杂合体为模板，利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一
链
Strand ExchangeMutagenesis）
运用杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度有差别的单链
（正义引物） AGSP:基因特异引物
（反义引物）
盒式P CR原 理示 意图
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
第一节 PCR扩增法获得目的基因
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增， 得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
方法 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否
已超螺旋状态存在，分离抽提比YAC容易 高 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR )
反向PCR 以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进行PCR扩增
第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA；
TAP处理全长的mRNA，去掉其帽子结构，保留 5’端的一个磷酸基团
设计锚定序列，具OP和IP区，用T4 RNA连接 酶，将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接
酵母菌的基因工程课件
拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
基因工程ppt第八章基因工程
• 目的基因的制备 • 载体的选择(xuǎnzé)和制备 • DNA分子的体外连接 • 将外源DNA导入宿主细胞 • 目的基因的筛选和鉴定
第五十页，共83页。
目的(mùdì)基因(target DNA) 的制备
• 目的(mùdì)基因（外于转化
基因工程(jīyīn gōngchéng)ppt第八章
基因工程(jīyīn
gōngchéng)
2021/11/7
第一页，共83页。
• 基因(jīyīn)克隆示意图
第二页，共83页。
第三页，共83页。
基因工程(jīyīn gōngchéng)大 事记
• 1973 Cohen第一例成功的克隆(kè lónɡ)实 验
第十三页，共83页。
第十四页，共83页。
第十五页，共83页。
• 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切 割序列，认为它由5-6个碱基组成
• 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000 碱基的片段(piàn duàn)。
• 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 • 限制性酶：HindⅡ
遗传信息转移过程 • 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入
外源DNA片段而获得新的表型的过程。
第六十三页，共83页。
目的(mùdì)基因的筛选和鉴 定(screening/selection)
• 遗传学方法 • 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志
第九页，共83页。
基因工程(jīyīn gōngchéng)
• 工具酶 • 载体 • 重组DNA技术的基本过程(guòchéng) • 真核细胞转染 • 克隆基因的表达
第十页，共83页。
第五十页，共83页。
目的(mùdì)基因(target DNA) 的制备
• 目的(mùdì)基因（外于转化
基因工程(jīyīn gōngchéng)ppt第八章
基因工程(jīyīn
gōngchéng)
2021/11/7
第一页，共83页。
• 基因(jīyīn)克隆示意图
第二页，共83页。
第三页，共83页。
基因工程(jīyīn gōngchéng)大 事记
• 1973 Cohen第一例成功的克隆(kè lónɡ)实 验
第十三页，共83页。
第十四页，共83页。
第十五页，共83页。
• 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切 割序列，认为它由5-6个碱基组成
• 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000 碱基的片段(piàn duàn)。
• 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 • 限制性酶：HindⅡ
遗传信息转移过程 • 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入
外源DNA片段而获得新的表型的过程。
第六十三页，共83页。
目的(mùdì)基因的筛选和鉴 定(screening/selection)
• 遗传学方法 • 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志
第九页，共83页。
基因工程(jīyīn gōngchéng)
• 工具酶 • 载体 • 重组DNA技术的基本过程(guòchéng) • 真核细胞转染 • 克隆基因的表达
第十页，共83页。
基因工程的原理和技术ppt
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序列, 又可以怎样操作？
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
思考:能否根据氨基酸得序列获得人胰岛 素基因得碱基序列？
化 学 合 成 法
一、基因工程得基本操作步骤(技术物 材料
提取
DNA
限制酶
DNA 片段
DNA分子
导入
受体菌 构建 基因组群体单链 RNA (mRNA)
杂交 双链
单链 D
继续保持安静
一、基因工程得基本操作步骤(技术提取
DNA
限制酶
DNA 片段
形成重组 DNA分子
导入
录
因随受 体细胞 得繁殖
而复制
如果就是导入动物细胞
显微注射仪
用口径为1μm得DNA注射器,将大 量得目得基因片段注入到受精卵得 核内,然后把经过注射得受精卵移植 到另一只雌性动物得子宫内,使受精
。 卵发育为转基因动物
思考: 培育转基因动物时,受体 细胞能否采用动物体细 胞？试说明理由。一般 可以采用动物得什么细 胞？
思考3: 如果我们已知蛋白质得氨基酸序 列,又可以怎样操作？
思考4:如果我们知道目得基因两端得部分 碱基序列,还可以怎样操作？
u 聚合酶链式反应(PCR技术)
Ø变性:双链DNA解链成 为单链DNA
Ø复性(退火):部分引物 与模板得单链DNA得 特定互补部位相配 对与结合
Ø延伸:以目得基因为 模板,合成互补得新 DNA链
农杆菌得Ti质粒T-DNA:(可转移得DNA)
可转移(也可以将目得基因转移)至受体细胞 中,并且整合到受体细胞染色体得DNA上。
农杆菌转化法
3、 转基因植物
农杆菌转化法
重组 DNA 分子
农杆菌 侵染 植物体细胞 (整合到细胞
基因工程菌发酵
基因工程药物制造实例
干扰素（interferon，IFN）是人体细 胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛 的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是 人体防御系统的重要组成部分。根据 分子结构和抗原性的差异分为α、β、 γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为 α1b α2a α2b等亚型。
1、基因工程菌的组建
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
2、质粒不稳定产生的原因 • 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； • 这两种菌比数率差异的大小。
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
平板培养基
10-12h
统计生长菌落数
重复三次,计算比值
(稳定性stability)
4、影响质粒稳定的因素
• 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对
其稳定性的影响； • 宿主对质粒稳定的影响； • 质粒拷贝数；
• 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响。
5、使质粒稳定的措施
组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力
基因工程的基本原理和技术ppt课件
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
48
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ（Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R）
36
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
37
③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
38
寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基
因的连锁互换定律。
11
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从
一种生物个体转移到另一种生物个体。
12
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。13
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
46
课堂练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
47C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
第8章 酵母基因工程 基因工程原理与技术 刘志国 课件
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，
但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢 酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得
基因基底水平表达
GAL80
GAL10 GAL4 Promoter
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱 氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组 在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子
酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。 YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（ CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。 YAC载体在宿主细胞中 以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC 还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb 的外源DNA片段。
第八章酵母基因工程详解
显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因 编码产物 氨基糖苷转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 遗传表型 抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺
aph cat dhfr
cup1
suc2 ilv2
铜离子螯合物
蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶
耐受铜离子
耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
特点：转化率高（105 / mg DNA）、操作简便、适用范围广
5 外源DNA在酵母宿主细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 外源DNA常通过同源或非同源方式与染色体DNA重组 线性化DNA更易于同源重组
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长 迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯 德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因 的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种 具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点
二、酵母转化系统
三、甲醇酵母表达系统
四、丝状真菌表达系统
一、真菌表达系统的优缺点
具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点
具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距
基因工程的原理和技术PPT课件
（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
（3）如果是导入微生物（如细菌）
目的基因
重组质粒
氨苄青霉素抗性基因
（标记基因）
将细菌用CaCl2处理，使 细胞处于感受态，可促 进细胞吸收DNA分子
大肠杆菌的拟核
用限制酶 切成许多
片断
②利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基 因。
聚合酶链式反应（PCR技术）
变性：双链DNA解链 成为单链DNA
复性（退火）：部 分引物与模板的单 链DNA的特定互补部 位相配对和结合
延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
1.第一步：目的CR)技术扩增目的 基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因基 因的许多DNA片断，导入受 体菌的群体储存，各个受体 菌体
小片段DNA
重组DNA分抗虫蛋 白的菌落
该菌落所携带 形成重组DNA分子（构建基因表达载体)
通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的 粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子 （基因表达载体）。
用荧光分子或放射性 同位素标记
看能否形 成杂合的
双链区
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
检测—
方法: DNA分子杂交
过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA B.用含目的基因的DNA片段( 单链)用放射性同位素等作标 以此做探针 C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中
《酵母基因工程》课件
药物
利用酵母细胞生产某些药物的活性成分或中间体，可降低生产成本和提高产量。
改良农作物和食品品质
农作物改良
通过基因工程技术将优良性状基因转入酵母细胞，再将其返回植物细胞，实现农作物的 遗传改良，提高产量和抗逆性。
食品品质
通过酵母基因工程改良食品加工过程中的菌种，提高食品的口感、营养价值和安全性。
基因治疗和基因组编辑
基因治疗
利用酵母基因工程技术将正常基因转入 病变细胞，替代或修复缺陷基因，从而 达到治疗遗传性疾病和恶性肿瘤的目的 。
VS
基因组编辑
通过酵母基因工程技术实现精准的基因组 编辑，如CRISPR-Cas9系统，可对人类 、动物和植物的基因进行精确的敲除、插 入和突变等操作，为遗传疾病治疗、农作 物改良等领域提供有力工具。
04
CATALOGUE
酵母基因工程面临的挑战和解决方案
基因表达调控的复杂性
总结词
酵母基因表达调控涉及多个层面，包括转录 、转录后和翻译后调控，具有高度复杂性。
详细描述
酵母基因表达调控涉及转录因子、顺式元件 和反式元件之间的相互作用，以及mRNA的 稳定性、翻译效率和蛋白修饰等。这些因素 共同决定了基因的表达水平和细胞命运。
02
CATALOGUE
酵母基因工程的工具和技术
基因克隆和鉴定技术 样本中分离出来，获得其DNA序 列的过程。
基因鉴定
利用分子生物学技术，如测序、 基因表达谱分析等，对克隆得到 的基因进行功能、结构和表达特 征的鉴定。
酵母转化技术
药物。
基因治疗
利用酵母作为载体，将 外源基因导入人体细胞 内，治疗遗传性疾病和
癌症。
生物能源
通过基因工程手段改良 酵母，提高其生物燃料
利用酵母细胞生产某些药物的活性成分或中间体，可降低生产成本和提高产量。
改良农作物和食品品质
农作物改良
通过基因工程技术将优良性状基因转入酵母细胞，再将其返回植物细胞，实现农作物的 遗传改良，提高产量和抗逆性。
食品品质
通过酵母基因工程改良食品加工过程中的菌种，提高食品的口感、营养价值和安全性。
基因治疗和基因组编辑
基因治疗
利用酵母基因工程技术将正常基因转入 病变细胞，替代或修复缺陷基因，从而 达到治疗遗传性疾病和恶性肿瘤的目的 。
VS
基因组编辑
通过酵母基因工程技术实现精准的基因组 编辑，如CRISPR-Cas9系统，可对人类 、动物和植物的基因进行精确的敲除、插 入和突变等操作，为遗传疾病治疗、农作 物改良等领域提供有力工具。
04
CATALOGUE
酵母基因工程面临的挑战和解决方案
基因表达调控的复杂性
总结词
酵母基因表达调控涉及多个层面，包括转录 、转录后和翻译后调控，具有高度复杂性。
详细描述
酵母基因表达调控涉及转录因子、顺式元件 和反式元件之间的相互作用，以及mRNA的 稳定性、翻译效率和蛋白修饰等。这些因素 共同决定了基因的表达水平和细胞命运。
02
CATALOGUE
酵母基因工程的工具和技术
基因克隆和鉴定技术 样本中分离出来，获得其DNA序 列的过程。
基因鉴定
利用分子生物学技术，如测序、 基因表达谱分析等，对克隆得到 的基因进行功能、结构和表达特 征的鉴定。
酵母转化技术
药物。
基因治疗
利用酵母作为载体，将 外源基因导入人体细胞 内，治疗遗传性疾病和
癌症。
生物能源
通过基因工程手段改良 酵母，提高其生物燃料
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酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性 繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知 菌类，共由56个属和500多个种组成。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
主要结构：
①两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以 保持重组YAC为线状结构； ⑤在两个末端序列中间，有一段填充序 列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞 中稳定扩增； ⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于
aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2
氨基糖苷转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 铜离子螯合物 蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
第二节 常见的酵母基因表达系统
一、 酿酒酵母表达系统
1，启动子
组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子 、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子
酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子 a – a 型启动子
受体细胞基因组 25℃ Sir3-8TS
重组质粒
a1 a 型启动子
hmla2-102 MATa
a 型启动子
35℃ Sir3-8TS
a2 （–）
a1 a 型启动子
hmla2-102
MATa a1
a 型启动子
酿酒酵母有a和a两种单倍 体，分别由MATa和MATa 两个等位基因决定。
Li+盐转化方法 ：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质 粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤 酵母转化一般用氯化锂有效
优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）
酵母菌转化方法
电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的 不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子 和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。 表达系统优势： 生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可诱导表达
用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基 因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困 难
用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因
其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编码产物
遗传表型
目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该 系统中获得成功表达。
第一节 酵母基因工程表达体系 --------达50至100个。
RAF
IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 STB REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点
裂殖酵母属 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油
2 酵母载体的种类
酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的 DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞 和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关 的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新 载体称为YCp .YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性 ，但拷贝数只有1 - 5个。
酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制 起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自 主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数 可以达上百个（c）。
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，
染色体上每30-40 kb就有一个ARS元件。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个， 但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于 分配不均匀所致。
优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围 广；转化率高（达105 / mg DNA）。
PEG转化法：PEG 1000
酵母细胞转化特点
单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍 单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或 同源整合入染色体（不含复制子）
克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子 总数的50-80%
常用的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酿酒酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵亚母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 假丝酵母属 产朊假丝酵母 (Candida utilis) 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
a1因子决定a细胞特征表达 a2因子阻遏a细胞特征表达 a1-a2阻遏a细胞特征表达 编码a2因子的基因突变型
hmla2-102能产生a2变体，
它能灭活a1，同时阻遏a型
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子
酿酒酵母
基因基底水平表达
的半乳糖
利用酶系
由GAL1
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
GAL7和 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达
GAL10
基因编码
GAL80 GAL10 GAL4 Promoter
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱 氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组 在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传 操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定 为安全的基因工程受体系统 酵母菌是最简单的真核模式生物
第八章 酵母基因工程
第一节 酵母基因工程表达体系
酵母基因表达宿主系统 酵母菌表达载体 酵母菌的转化系统
第二节 常见的酵母基因表达系统
第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 酵母基因工程应用举例------利用 重组酵母生产乙肝疫苗
第一节 酵母基因表达体系 ---------------宿主系统
酵母菌的分类学特征
酵母菌Sup4 tRNA基因内。
酵母菌的转化系统
酵母菌的转化方法 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌转化方法
原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体 在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然 后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可 达原生质体总数的1-2%。
2 酵母载体的种类
酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体 两类
酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分 类。分为下列五类 ：
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
主要结构：
①两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以 保持重组YAC为线状结构； ⑤在两个末端序列中间，有一段填充序 列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞 中稳定扩增； ⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于
aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2
氨基糖苷转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 铜离子螯合物 蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
第二节 常见的酵母基因表达系统
一、 酿酒酵母表达系统
1，启动子
组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子 、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子
酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子 a – a 型启动子
受体细胞基因组 25℃ Sir3-8TS
重组质粒
a1 a 型启动子
hmla2-102 MATa
a 型启动子
35℃ Sir3-8TS
a2 （–）
a1 a 型启动子
hmla2-102
MATa a1
a 型启动子
酿酒酵母有a和a两种单倍 体，分别由MATa和MATa 两个等位基因决定。
Li+盐转化方法 ：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质 粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤 酵母转化一般用氯化锂有效
优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）
酵母菌转化方法
电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的 不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子 和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。 表达系统优势： 生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可诱导表达
用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基 因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困 难
用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因
其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编码产物
遗传表型
目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该 系统中获得成功表达。
第一节 酵母基因工程表达体系 --------达50至100个。
RAF
IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 STB REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点
裂殖酵母属 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油
2 酵母载体的种类
酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的 DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞 和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关 的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新 载体称为YCp .YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性 ，但拷贝数只有1 - 5个。
酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制 起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自 主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数 可以达上百个（c）。
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，
染色体上每30-40 kb就有一个ARS元件。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个， 但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于 分配不均匀所致。
优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围 广；转化率高（达105 / mg DNA）。
PEG转化法：PEG 1000
酵母细胞转化特点
单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍 单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或 同源整合入染色体（不含复制子）
克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子 总数的50-80%
常用的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酿酒酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵亚母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 假丝酵母属 产朊假丝酵母 (Candida utilis) 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
a1因子决定a细胞特征表达 a2因子阻遏a细胞特征表达 a1-a2阻遏a细胞特征表达 编码a2因子的基因突变型
hmla2-102能产生a2变体，
它能灭活a1，同时阻遏a型
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子
酿酒酵母
基因基底水平表达
的半乳糖
利用酶系
由GAL1
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
GAL7和 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达
GAL10
基因编码
GAL80 GAL10 GAL4 Promoter
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱 氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组 在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传 操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定 为安全的基因工程受体系统 酵母菌是最简单的真核模式生物
第八章 酵母基因工程
第一节 酵母基因工程表达体系
酵母基因表达宿主系统 酵母菌表达载体 酵母菌的转化系统
第二节 常见的酵母基因表达系统
第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 酵母基因工程应用举例------利用 重组酵母生产乙肝疫苗
第一节 酵母基因表达体系 ---------------宿主系统
酵母菌的分类学特征
酵母菌Sup4 tRNA基因内。
酵母菌的转化系统
酵母菌的转化方法 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌转化方法
原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体 在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然 后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可 达原生质体总数的1-2%。
2 酵母载体的种类
酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体 两类
酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分 类。分为下列五类 ：