第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件

主要结构：
①两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以 保持重组YAC为线状结构； ⑤在两个末端序列中间，有一段填充序 列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞 中稳定扩增； ⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于
常用的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酿酒酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵亚母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 假丝酵母属 产朊假丝酵母 (Candida utilis) 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
Li+盐转化方法 ：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质 粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤 酵母转化一般用氯化锂有效
优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）
酵母菌转化方法
电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的 不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子 和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入
酵母菌Sup4 tRNA基因内。
酵母菌的转化系统
酵母菌的转化方法 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌转化方法
原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体 在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然 后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可 达原生质体总数的1-2%。
目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该 系统中获得成功表达。
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酿酒酵母中的2m环状质粒
环状质粒，拷贝数达50至100个。
RAF
IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 STB REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性 繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知 菌类，共由56个属和500多个种组成。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制 起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自 主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数 可以达上百个（c）。
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，
染色体上每30-40 kb就有一个ARS元件。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个， 但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于 分配不均匀所致。
第八章 酵母基因工程
第一节 酵母基因工程表达体系
酵母基因表达宿主系统 酵母菌表达载体 酵母菌的转化系统
第二节 常见的酵母基因表达系统
第三节 影响外源基因表达的因素 第四节 酵母基因工程应用举例------利用 重组酵母生产乙肝疫苗
第一节 酵母基因表达体系 ---------------宿主系统
酵母菌的分类学特征
第一节
酵母基因工程表达体系 -------载体
1．酵母载体的基本结构
DNA复制起始区：2μ质粒的复制起始区及酵母基因组的 自主复制序列（autonomously replicating sequence，ARS）
筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选
整合介导区
有丝分裂稳定区
表达盒： 启动子 ，基因（分泌信号序列 ），终止子
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围 广；转化率高（达105 / mg DNA）。
PEG转化法：PEG 1000
酵母细胞转化特点
单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍 单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或 同源整合入染色体（不含复制子）
克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子 总数的50-80%
酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核 酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包 括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素 抗性基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时 增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分， 主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序 列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列) ，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
a1因子决定a细胞特征表达 a2因子阻遏a细胞特征表达 a1-a2阻遏a细胞特征表达 编码a2因子的基因突变型
hmla2-102能产生a2变体，
它能灭活a1，同时阻遏a型
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子
酿酒酵母
基因基底水平表达
的半乳糖
利用酶系
由GAL1
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。
YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（ CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。 YAC载体在宿主细胞中 以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC 还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb 的外源DNA片段。
醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢
酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得
有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能 大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。
乳酸克鲁维酵母表达系统
裂殖酵母属 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油
用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基 因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA 等 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困 难
用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因
其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编Байду номын сангаас产物
遗传表型
可控性启动子：半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸酶启动 子（PHO）、乙醇脱氢酶（ADH2）启动子、Cu2+螯合蛋白启 动子（CUPI）以及交配a型阻遏系统（MATa/a）
酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子
pho4TS-PHO5启动子：
酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开 PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子 PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活 因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭 23℃诱导表达
2 酵母载体的种类
酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的 DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞 和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关 的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新 载体称为YCp .YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性 ，但拷贝数只有1 - 5个。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。 表达系统优势： 生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可诱导表达
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
2 酵母载体的种类
酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体 两类
酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分 类。分为下列五类 ：
酵母整合型质粒YIp： 缺乏酵母的复制起始位点，不 能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因 。具有整合介导区， 所以，它只有整合到酵母染色体 中才能稳定(a)。
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传 操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定 为安全的基因工程受体系统 酵母菌是最简单的真核模式生物
aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2
氨基糖苷转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 铜离子螯合物 蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
第二节 常见的酵母基因表达系统
一、 酿酒酵母表达系统
1，启动子
组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子 、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子
GAL7和 半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达
GAL10
基因编码
GAL80 GAL10 GAL4 Promoter
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱 氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组 在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子
酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子 a – a 型启动子
受体细胞基因组 25℃ Sir3-8TS
重组质粒
a1 a 型启动子
hmla2-102 MATa
a 型启动子
35℃ Sir3-8TS
a2 （–）
a1 a 型启动子
hmla2-102
MATa a1
a 型启动子
酿酒酵母有a和a两种单倍 体，分别由MATa和MATa 两个等位基因决定。